瘦素及其受体和血管内皮生长因子在正常子宫内膜中的表达及在血管形成中的作用

瘦素（Leptin，LEP）是肥胖基因的表达产物，是由脂肪组织及少量其他组织分泌的激素，也称肥胖抑素，LEP通过与其受体结合发挥生物学作用。瘦素受体(Ob gene receptor，Ob-R)是由糖尿病基因编码的单链跨膜糖蛋白。已知的Ob-R有6种异构体，分别命名为：Ob-Ra、Ob-Rb、Ob-Rc、Ob-Rd、Ob-Re和Ob-Rf，其中Ob-Re为可溶性受体，存在于血液循环中，作为转运蛋白，其余5种异构体均为单跨膜受体；Ob-Rb为长型受体，作为主要功能受体，其它均为短型受体，广泛存在于人体各种组织中，如下丘脑、心、肾、子宫内膜等。LEP与受体结合后通过JAK/STAT信号转导途径，参与机体多种功能，调节摄食、能量代谢、生长、免疫过程、促进生殖，参与肿瘤形成等。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种特异地作用于血管内皮细胞的多功能细胞因子，具有促进微静脉、小静脉通透性增加，血管内皮细胞分裂、增殖，细胞质钙聚集以及诱导新生血管形成等作用。本研究通过检测LEP、Ob-R和VEGF在正常子宫内膜增殖期和分泌期的表达，探讨LEP、Ob-R和VEGF在子宫内膜血管形成中的作用。

    1  对象与方法

    1.1  对象  选择120例月经周期规律的生育年龄妇女的子宫内膜，其中增殖期60例，分泌中期60例(排卵后6～8天，即着床窗口期)。120例妇女年龄27～37岁，平均年龄30岁，3个月内未用过任何激素。

    1.2  试剂  兔抗人瘦素多克隆抗体Leptin(BA-1231)、兔抗人Ob-R多克隆抗体(BA-1233)、SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德公司，鼠抗人VEGF-165单克隆抗体购于福州迈新公司。

    1.3  免疫组化染色方法  按SP染色试剂盒说明书操作，所用抗体均为即用型抗体，染色时均需用EDTA抗原修复液进行微波修复抗原，PBS代替一抗做阴性对照，苏木素复染。

    1.4  结果判定  LEP、Ob-R和VEGF蛋白均为胞浆着黄色,判断阳性采用半定量标准，以双盲法进行评分。每张切片随机观察10个有代表意义的高倍视野，每个视野计数100个细胞中的阳性细胞数，取平均值作为结果。表达阴性和阳性根据细胞染色强度和染色细胞所占面积，即两者积分之和来判断。染色强度分为：不染色为0，轻度染色为1，中度染色为2，强度染色为3。染色面积分为：无细胞染色为0， ＜25%细胞染色为1， 25%～50%细胞染色为2， ＞50%细胞染色为3。二者积分之和为0～2为表达阴性，两者积分之和＞2为阳性。

    1.5  统计学处理  用SPSS10.0软件包对所得数据进行χ2检验和Spearman相关分析，以α=0.05为检验水准。

    2  结果

    LEP及Ob-R阳性着色以胞浆为主，少量间质中亦可见阳性表达。LEP在增殖期和分泌期内膜中的表达差异无统计学意义(P＞0.05)；Ob-R在分泌期子宫内膜的表达明显高于增殖期，差异有统计学意义(P＜0.05)。VEGF-165阳性着色以胞浆为主，少量胞膜、间质中亦可见阳性表达。于分泌期子宫内膜腺上皮细胞的表达高于增殖期，两者差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。表1  不同子宫内膜组织中LEP，Ob-R 和VEGF的表达情况在60例分泌期子宫内膜中，Ob-R和VEGF表达存在显著正相关性(r=0.288，P＜0.05)。

    3  讨论

    3.1  LEP及Ob-R在正常子宫内膜的表达及意义  LEP是肥胖(Ob)基因(位于人类染色体7q32)所编码的一种分泌性蛋白质，其主要功能是调节能量平衡。Ob-R属Ⅰ类细胞因子受体家族，现至少发现有6种异构体(isoform)。该家族共同的传递途径为JAK-STAT，配体与受体结合后，激活JAK激酶，使JAK酪氨酸磷酸化后与磷酸化受体结合，进一步使下游胞浆蛋白STAT磷酸化，STAT磷酸化后转入核内特定DNA结合区，启动目的基因转录。最近的研究表明，LEP可促进发育、启动青春期、调节生殖功能[1]。
 LEP在子宫内膜的表达情况报道不一致。Gonzalez RR等[2]应用PT-PCR、Western blot和免疫组化方法检测到中分泌期子宫内膜LEP的表达。而After等[3]仅检测到LEP蛋白在子宫内膜表达，未发现LEPmRNA的表达。After等报道Ob-R在有正常月经周期的妇女子宫内膜分泌期中期和增殖期晚期表达最强，在分泌期早期表达为阴性或弱阳性，而在低生育力及不孕患者分泌期中期和增殖期晚期子宫内膜呈弱阳性或无表达。我们通过免疫组织化学技术分析显示，LEP及Ob-R在子宫内膜的腺体及间质均有表达；Ob-R在子宫内膜增殖期向分泌期演进过程中表达增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；LEP在分泌期子宫内膜的表达也有增强，但差异无统计学意义（P＞0.05）。Ob-R在分泌中期(着床窗口期)内膜表达高于增殖期，提示在子宫内膜组织的表达呈周期性变化，与After等的报道相符。Ob-R在分泌期子宫内膜表达增强，可能参与分泌期螺旋小动脉迂曲的形成，为孕卵着床和早期胚胎植入准备条件。

    3.2  VEGF在子宫内膜中的表达及意义  VEGF是一种肝素结合性同源二聚体糖蛋白，分子量为34～45kd，可特异地作用于血管内皮细胞，在不同条件下对血管生成起关键作用。VEGF的血管生成活性由其异构体和受体调节。目前已知有5种VEGF异构体，包括VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206，均系由VEGF基因转录时的不同拼接形成。VEGF异构体VEGF-165属VEGF主要的分子类型，可由各种正常和转化细胞产生，能促进血管内皮细胞有丝分裂，且有增加内皮细胞通透性作用。在子宫内膜细胞中，VEGF随月经周期发生相应变化，可促进血管内皮细胞增殖、迁移、增加微血管通透性，参与了胚胎发育、肿瘤生长、炎症反应等病理过程[4]。VEGF mRNA及蛋白主要局限在子宫内膜腺上皮细胞及血管周围的上皮细胞，也分散于周围的间质中，于增殖中晚期、分泌期均有较高的表达[5]。本实验研究表明，VEGF在正常子宫内膜腺体及间质均有表达，在分泌期内膜表达高于增殖期，差异有统计学意义（P＜0.05）。快速发表论文

    最近研究发现，LEP是一种促血管生成因子，可促进血管生成和增加血管通透性[6]。血管内皮细胞上存在Ob-R，是LEP的靶细胞之一。LEP可直接作用于血管内皮细胞上的Ob-R，使其磷酸化而激活信号转录因子STAT3，促进血管内皮细胞增殖，促血管生成。最近Choi[7]研究发现Ob-R表达于卵巢癌细胞表面，表达强度和微血管密度密切相关。Yamagishi等[8]报道，LEP可上调VEGF表达。Kitade等[9]通过大鼠试验表明，LEP的促血管生成作用及与VEGF的协同作用在非酒精性肝硬化发展为肝纤维化及肝癌的过程中发挥重要作用，并且LEP通过促进VEGF生成发挥血管生成作用。本实验对LEP、Ob-R和VEGF在子宫内膜增殖期和分泌期的表达进行了相关分析，发现在分泌期内膜中Ob-R与VEGF的表达呈正相关，且随着增殖期向分泌期演进，Ob-R和VEGF均明显表达增高。

    综上所述，我们认为LEP及其受体以双重表达的形式存在子宫内膜，有可能通过促进VEGF分泌而发挥促血管生成作用，在分泌期作用尤其明显，利于胚胎着床。有关子宫内膜中LEP、Ob-R与VEGF的具体作用机制则有待于更进一步的研究。