糖尿病大鼠血管钙化的实验研究

血管钙化是动脉粥样硬化、肾病、衰老、高血压等多种疾病的病理生理基础［1-3］。血管钙化与动脉硬化斑块关系密切，氧化脂类物质和氧化应激引起的慢性炎症对血管钙化的发生、发展可能具有促进作用［4］。糖尿病是常见病、多发病，其患病率正随着人民生活水平的提高，人口老龄化，生活方式的改变而迅速增加。糖尿病是由于胰岛素分泌缺陷和(或)胰岛素作用缺陷而引起。糖尿病人群中动脉粥样硬化的患病率较高，发病年龄较轻，病情进展也较快。国外报道在糖尿病病人体内存在冠状动脉钙化、瓣膜钙化以及其他部位的血管钙化，从而导致冠心病等心血管疾病的发生，表明在高糖的环境中可以诱导细胞增殖和骨桥蛋白的表达［5］。但是糖尿病性大血管病变尤其是血管钙化间的关系目前未完全明了，糖尿病时发生血管钙化的确切机制也尚不清楚。本研究在大鼠血管钙化的模型上，观察糖尿病对血管钙化的影响，以探讨糖尿病与血管钙化间的关系及其可能机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料  雄性Sprague-Dawley大鼠180～200g，清洁级，由宁夏医科大学实验动物中心提供。链脲佐菌素(STZ)、尼古丁购自Sigma公司；维生素D3购自上海通用药材有限公司；大鼠骨钙素、TNF放免试剂盒购自北京科美东雅生物技术有限公司；碱性磷酸酶测试盒购自南京建成生物技术有限公司；其余试剂均为市售分析纯。

　　1.2  实验分组及大鼠模型的制备  参照文献［6-7］方法制备大鼠血管钙化和糖尿病模型，取24只雄性SD大鼠(体重180～200 g)，随机分为4组，每组6只。①钙化组(VDN)：维生素D3(300 000 IU/kg)肌肉注射，同时尼古丁(25 mg/kg 溶于花生油)灌胃，9h后尼古丁重复灌胃1次；②糖尿病组(DM)：将STZ 溶解于0.1 mol/L、pH 4.5、无菌的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液中，制成浓度为12 mg/mL(1.2％)的STZ液，腹腔注射STZ 60mg/kg，72h 后血糖值≥16.67 mmol/L 为DM大鼠［8］；③钙化＋糖尿病组(VDN+DM，简称糖尿病干预组)：同时①②操作；④对照组(CON)：操作同①②，肌肉注射生理盐水和单纯花生油灌胃，腹腔注射等量的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。
   
　　饲养室内通风良好，室温18～25℃，相对湿度40％～70％，每日12h光照维持，昼夜循环，饲养时间为9～11月份。自由摄食、饮水。定期称重(每3天1次)，钙化处理6周后乌拉坦1 g/kg腹腔注射麻醉，心脏取血，肝素抗凝，分离血浆，-70℃冻存备用。摘取全长胸腹主动脉，取5 mm升主动脉用10％中性福尔马林固定，用于组织学观察，其余部分作下述测定。

　　1.3  血管组织总钙含量测定［8］
   
　　取胸主动脉(约10mg)80℃烤干，加入2mol/L硝酸0.5mL，180℃消化并烤干，冷却后加入去离子水(含27nmol/L的氯化钾和27μmol/L的氯化镧)10 mL复溶，取2 mL加入1 %氯化锶100μL，原子吸收分光光度计(Jena，novAA300)在422.7nm 处读取吸光度，测定组织的钙含量(以μmol/g·dw 表示)。

　　1.4  血浆及血管组织碱性磷酸酶(ALP)活性测定
   
　　约10 mg胸主动脉，以等渗PBS 制备组织匀浆，4℃8 000×g离心10 min，吸取上清液，以考马斯亮蓝法行蛋白定量。按照ALP 测定试剂盒说明书，采用磷酸苯二钠(金氏)法测定ALP 活性(用U/mg·pro 表示)。

　　1.5  血浆及血管组织骨钙素(OC)和肿瘤坏死因子(TNF)浓度测定
   
　　主动脉用PBS 匀浆离心后，按照试剂盒说明书，采用放射免疫法测定血浆及主动脉骨钙素的浓度(用ng/g·pro 表示)和肿瘤坏死因子浓度(用ng/g·pro 表示)。

　　1.6  Von Kossa染色［8］
   
　　血管组织进行石蜡包埋、切片，常规脱蜡、脱水后浸入5%的硝酸银溶液中，在日光下照射60 min，再用2.5%的硫代硫酸钠溶液处理5 min，然后依次用碱性品红复染，经脱水、透明、封固，在光镜下观察。

　　1.7  统计学方法
   
　　数据以均值±标准差表示(±s)，两样本均数间比较采用t检验，多样本均数间比较采用One-way ANOVA检验，组间的两两比较采用Student-Newman-Keuls(SNK)方法检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2  结果

　　2.1  大鼠血管钙化特征
   
　　血管Von Kossa 染色见钙化组血管，尤其是中膜弹性纤维间有大量黑色颗粒，沉积于细胞外基质和平滑肌细胞内，部分聚集成团并形成钙结节，表明存在钙沉积；正常组和糖尿病组血管未见黑色颗粒(图1，见封3)。钙化组大鼠主动脉ALP活性、OC浓度和钙含量分别较对照组高2.83倍、84.12％%和1.98倍；钙化组大鼠血浆ALP活性和OC浓度分别较对照组高1.90倍和93.02％(P均＜0.01)，见表1。

　　2.2  糖尿病促进大鼠血管钙化作用
   
　　与单纯钙化组相比较，糖尿病干预后大鼠血管中膜弹力纤维的黑色颗粒明显增多，大量钙结节形成，呈灶状分布，并有大量弹力纤维的断裂，表明明显增强了血管组织的钙沉积(图1)。与对照组相比，单纯糖尿病组大鼠血浆ALP活性和OC浓度分别高1.20倍(P＜0.01)和24.81％(P＜0.05)；主动脉ALP活性、OC浓度和钙含量有升高，但无显著性差异。与单纯钙化组相比较，糖尿病干预组大鼠主动脉ALP活性、OC浓度和钙含量分别高16.47％(P＜0.05)、50.14％和93.76％(P＜0.01)；血浆ALP 活性和OC 浓度分别高70.63％和22.49％(P均＜0.01)，见表1。

　　表1  血浆碱性磷酸酶、骨钙素及主动脉碱性磷酸酶、骨钙素和钙含量的变化（略）

　　与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与VDN组比较# P＜0.05，## P＜0.01

　　2.3  糖尿病对血管钙化大鼠血浆及主动脉肿瘤坏死因子水平的影响
   
　　糖尿病组大鼠血浆及主动脉TNF水平较对照组分别增高60.00％(P＜0.01)和12.07％(P＞0.05)。钙化组大鼠血浆及主动脉TNF水平分别较对照组高86.25％和1.17倍(P均＜0.01)。与钙化组相比较，糖尿病干预组大鼠血浆及主动脉TNF水平分别高26.85％(P＜0.05)和37.30％(P＜0.01)，见表2。

　　表2  血浆、主动脉肿瘤坏死因子含量的变化（略）

　　与对照组比较* P＜0.01；与VDN组比较 # P＜0.05，## P＜0.01

　3  讨论
   
　　血管钙化损伤心血管功能，导致血栓形成、粥样硬化斑块破裂等严重后果，是心血管事件(心肌梗死和脑卒中等)的重要危险因子，也是导致血管性疾病的死亡及致残的重要原因［1］。血管钙化的确切机制目前尚未阐明，可能与钙磷代谢失衡、血管局部调节因子(如肿瘤坏死因子、血管紧张素Ⅱ、尾加压素Ⅱ等)、氧自由基、趋钙激素等多种因素作用于血管组织有关；而且钙化的血管平滑肌细胞(VSMCs)的表型发生转变，细胞特征消失，功能紊乱，导致心血管功能失衡。血管钙化可发生在代谢性疾病(维生素D过量或者缺乏)、遗传性疾病(先天性血管瘤)、感染等情况。糖尿病是代谢性疾病的一种，目前其发病率在全球有逐年上升趋势，且常并发血管损伤，如动脉粥样硬化等。但糖尿病对血管钙化的作用及其机制迄今尚未见报道。
   
　　大剂量维生素D3可造成动脉组织钙沉积，尼古丁可增强维生素D3 的反应，二者合用可导致动物心血管组织钙过度负荷模型；较大剂量STZ 诱导糖尿病大鼠其机制是破坏胰岛细胞导致胰岛功能衰竭，血糖明显升高。本实验观察到给大鼠肌注维生素D3 和尼古丁灌胃6周后，大鼠主动脉组织及血浆ALP活性、OC 及钙含量显著高于对照组大鼠，血管Von Kossa染色呈典型钙化结节，血管明显钙化，与文献报道一致［6］。经糖尿病干预后，血管组织钙化指标均升高，Von Kossa染色显示血管钙化结节加重，并伴有大量弹力纤维的断裂，提示糖尿病具有促进血管钙化的作用。高中数学论文发表
   
　　血管钙化时血管组织及细胞旁/自分泌功能的变化以及这些变化在血管钙化发生和发展中的意义，目前均不清楚。TNF是一种由骨原细胞产生的多效性细胞因子，有研究证实TNF在血管和骨的病理生理学中发挥重要作用，并且发现TNF可促使平滑肌细胞向血管内皮下浸润、聚集和增生，使内膜增厚，从而促进粥样硬化的形成［9］。TNF还可通过抑制成骨细胞的功能、刺激骨吸收，影响骨代谢的调节［10］。本实验研究结果显示血管钙化时TNF水平升高，表明TNF参与血管钙化的发生、发展；予以糖尿病干预后的钙化组大鼠血管钙化指标增高，血浆和血管TNF含量明显增高，且较钙化组差异均显著，提示糖尿病对血管钙化的促进效应可能与上调体内TNF表达有关。
   
　　本实验观察到糖尿病可促进血管钙化的发生、发展，以及血管钙化时血浆和血管组织TNF含量增加，而给予糖尿病干预可使钙化大鼠血浆和血管组织的TNF上调。本研究提示：糖尿病对血管钙化具有促进效应；糖尿病促进钙化的效应可能部分与血浆和血管组织的TNF有关。糖尿病与其他钙化调节因子如血管紧张素和尾加压素等的关系值得进一步研究。高中数学论文发表