耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究

葡萄球菌的分型方法很多，传统的分型方法包括血清学分型、抗生素分型等，但均无法满足精确辨别的要求。分子生物学技术的出现为这一领域带来了革命。目前，分子分型方法已成为研究细菌耐药性发生及传播的重要手段，常见的有：脉冲场凝胶电泳(pulsed-fiel gel electrophoresis, PFGE)，随机扩增DNA多态性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)，mecA基因高变区长度多态性(PCR for the mec-associated hypervariable region, HVR-PCR)，荧光扩增片段长度多态性(fluorescent amplified fragment length polymorphrism, FAFLP)等。这些方法各有特点，应用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureu, MRSA)的分型在国内外均有报道，但这些方法尚未成熟，各地分型标准也不一样，且多采用单一的分型方法。RAPD 和HVR-PCR联合应用于MRSA多态性分型尚未见报道。本实验采用RAPD和HVR-PCR两种方法对MRSA菌株进行分型，了解其多态性分布状况、鉴别菌株之间的相关性，为合理、有效地使用抗生素和控制耐药基因在种群间的传播提供理论基础。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　1.1.1标本来源实验用的31株MRSA标本来源于2007年3月至2007年12月间西安交通大学医学院第一、第二附属医院的住院患者。

　　1.1.2实验仪器及试剂MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析;药敏试验纸片购自英国OXOID公司，Mueller-Hinton平板由本实验室自行配置;细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、PCR试剂2×Taq PCR MasterMix(含染料)、DNA Marker Ⅱ均购自北京TIANGEN生物技术有限公司;溶菌酶(活力单位>2000u/mg)、蛋白酶K购自Amrescos生物公司;金黄色葡萄球菌mecA基因PCR检测引物和HVR-PCR、RAPD多态性分析引物，由北京奥科生物技术有限责任公司合成。DNA扩增仪为MJ Research Inc公司的PTC-200 PCR仪;稳压稳流电泳仪为美国Bio-RAD公司产品;ZF紫外分析仪购自上海小源科技有限公司。

　　1.2方法

　　1.2.1细菌鉴定用MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析仪鉴定MRSA，同时用PCR检测mecA基因，凡头孢西丁(FOX，30μg)纸片药敏试验≤19mm的金黄色葡萄球菌，且mecA基因阳性者报甲氧西林耐药，即为MRSA。

　　1.2.2PCR引物根据GenBank中金黄色葡萄球菌MRSA基因序列选取适用引物：HVR引物序列为，P1：5′-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3′，P2：5′-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3′[1]，RAPD引物序列为，EP007：5′-AGCACGCTGTCAATCATGTA-3′[2]，KAY1：5′-AGCAGCCTGC-3′[2]。

　　1.2.3细菌DNA的提取按北京TIANGEN公司生产的细菌基因提取试剂盒(DP302)步骤，提取葡萄球菌基因组DNA。

　　1.2.4MRSA的HVR-PCR分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系：HVR P1和P2引物各1μL(引物浓度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水ddH2O 9.5μL，反应总体积为25μL。PCR反应条件：94℃预变性5min;94℃ 60s，56℃ 45s，72℃，60s，35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染后分析结果。

　　1.2.5MRSA的RAPD分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板，加入PCR反应体系：RAPD引物EP007 1μL(引物浓度10μmol/L)，RAPD引物KAY1 1μL(引物浓度10μmol/L)，2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl，含染料)，灭菌去离子水ddH2O 9.5μL，反应总体积为25μL。PCR反应条件：94℃预变性2min;94℃ 45s，34℃ 45s，72℃，60s，35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳后，在凝胶成像系统中进行成像分析。

　　2结果

　　2.1MRSA的HVR-PCR分型结果应用HVR-PCR方法对31株MRSA标本进行分型，一共可以分为7型，分别含有7、8、9、10、11、12和16个DRUs。所有的MRSA都可以扩增出长度450～820bp的基因片段，用HVR-PCR分型方法都可以加以区分，分型率达到了100%。DRUs的数目=(扩增的基因片段长度-171)/40，其中171是存在于扩增序列之中而没有重复的序列片段长度，40是每一个正向重复单元序列的长度。所有MRSA菌株中，10DRUs型最多(11/31，35.48%)，其次是9DRUs型(8/31，25.81%)，11DRUs型(4/31，12.90%)，7DRUs型(3/31，9.68%)，12DRUs型(2/31，6.45%)，8DRUs型(2/31，6.45%)，最少的是16DRUs型(1/31，3.23%)。结果见图1、表1中国论文发表
2.2MRSA的RAPD分型结果

　　2.2.1RAPD的电泳结果31株MRSA经过RAPD两条引物混合扩增分型，均可得到数量不等、位置不同的扩增条带，条带数目在1～6条之间，分型率达100%(图2)。图1MRSA的HVR-PCR电泳图Fig.1 The electrophoresis result of HVR-PCR of MRSAM：100bp ladder DNA Marker;1、3、6、10： PCR产物长531bp，9DRUs型;2、7：PCR产物长571bp，10DRUs型;4、9：PCR产物长611bp，11DRUs型;5、8：PCR产物长651bp，12DRUs型。表1HVR-PCR的分型结果

　　2.2.2MRSA聚类分析结果根据RAPD电泳图谱中条带的数目及位置，经NTSYS统计软件进行聚类分析，得到遗传距离树状图。31株MRSA共分10型，其中以Ⅳ型为主(10/31，32.26%)，其他型分布比较接近。根据遗传树状图分布情况可知各菌株间遗传性状，其中RAPD Ⅱ型、Ⅲ型差异较小，均有4条带;RAPD Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅵ型遗传性状也比较接近，各有4条带，但是条带在位置上有所差别;RAPD Ⅸ型、Ⅹ型差异较小，Ⅸ型有2条带，Ⅹ型只有1条带。遗传距离树状图和RAPD分型结果见图3。图2RAPD的电泳图Fig.2 The electrophoresis result of RAPD　　M：DNA Marker Ⅱ;1、2、3、5、9：RAPD Ⅳ型;4、6：RAPD Ⅵ型;7、8：RAPD Ⅹ型。

　　2.2.3RAPD与HVR-PCR对MRSA的联合分型

　　应用RAPD与HVR-PCR对31株MRSA进行联合分型，这两种方法的分型率都比较高，都达到了100%。在11株HVR-PCR分型的10DRUs型中RAPD Ⅳ型4株(36.36%)，RAPD Ⅲ型和RAPD Ⅵ型各2株(18.18%);10株RAPD Ⅳ型中9DRUs型、10DRUs型各4株(40.00%)(表2)。表2RAPD与HVR-PCR对MRSA的联合分型　图331株MRSA的遗传距离树状图Fig.3 The genetic distance tree of 31 MRSAs横坐标为相关系数，纵坐标为菌株编号。

　　3讨论

　　根据HVR多态性，将31株MRSA分为7型，以10DRUs型多见，共11株(35.5%)，16DRUs型少见，只有1株(3.23%)。SENNA等[1]报道，根据HVR多态性将从巴西Porto Alegre地区分离的254株MRSA分为8型。本实验未发现3DRUs型及5DRUs型，而多了16DRUs型，这可能与菌株数较少有关，也可能本地区无此型菌株存在，有待进一步研究。采用HVR-PCR 法对MRSA进行分型，与MRSA的表型分型法、药敏试验相结合，对于追踪MRSA感染源、控制流行、指导临床抗菌药物的合理应用具有重要意义。

　　另外，MRSA中dru不同重复次数有何具体生物学意义，即片段大小不同对PBP2a构型及其介导耐药性高低的关系有何影响，国内外尚无报道，有待进一步探讨。SCHMITZ等[3]用PFGE、RAPD、16-23S rDNA、蛋白APCR、HVR-PCR、凝固酶基因PCR对183株MRSA分型，发现PFGE结果与HVR-PCR结果相近，对MRSA都有比较高的区分能力。WICHELHAUS等[4]同时应用凝固酶基因多态性、spa基因多态性，mecA基因高变区长度多态性及PFGE对46株MRSA进行分子分型研究，证实了这3种特异功能集团的多态性分型方法与PFGE分型一致，适合于短时间如几天到几周内的流行病学分析，12h可出结果，而PFGE则需5d或更长时间。虽然HVR-PCR没有PFGE对MRSA分型效果好，但是比凝固酶基因PCR更能有效地对MRSA分型，而且分型率比较高，对其流行病学研究有重要的意义[5]。mecA基因是耐甲氧西林葡萄球菌所特有，而HVR基因高变区与该基因紧密相连，存在于其下游，也具有特异性。HVR-PCR法操作简单、快速，不需要特殊的电泳设备和限制酶消化，大多数的临床微生物实验室皆可进行。

　　本实验在药敏试验的基础上采用双引物RAPD法对31株MRSA进行了基因分型，根据RAPD电泳图谱中条带的数目及位置，经中国论文发表NTSYS统计软件进行聚类分析，得到遗传树状图。31株MRSA共分为10个基因型。韩立中等[6]用RAPD法将检测菌株分为4个型别(A～D型)，分型区别较大的原因可能是RAPD引物选择的不同，另外由于使用随机的引物，一旦基因组DNA分子发生片段插入、缺失或碱基突变，将造成引物特定结合位点的变化，使PCR扩增产物的条带发生分子量和数目的改变。WILLEM等[7]在美国纽约市立医院及纽约疾病控制中心共收集103株金黄色葡萄球菌，用RAPD分型方法共检测出71株MRSA，检出率高达69%，其中52株被认为与医院和社区感染有关，其他19株同源性相差较远，被认为是流行病学无关株。VAN BELKUM等[8]曾用3种RAPD引物(RAPD1、RAPD7和ERIC2)对金黄色葡萄球菌分型，并同PFGE作比较，证实RAPD是金葡菌基因分析以及监测医院感染流行较理想的分型手段。RAPD的特异性好、分析周期短、简易、稳定、可靠、不需要特殊试剂和生物材料，适用于所有生物的分型，尤其是对一些尚未建立标准分型方法和缺乏血清型等方法的菌属(种)的鉴定和分型特别实用。美国医院流行病学协会已推荐该方法为医院感染中常见病原菌的分型方法[9]。因此，RAPD技术在传染病学、微生物流行病学和医院内感染学领域有很好的应用前景。

　　在MRSA的流行病学研究中，往往会把几种方法联合使用，这样对MRSA的流行病学分析往往会更加准确。李家泰等[10]采用HVR-PCR基因型和肠毒素基因型相结合，发现两种基因型结合起来有助于提高MRSA分型的可靠性。本实验将RAPD方法与HVR-PCR方法相结合，以药物敏感实验为基础，对临床分离的MRSA做流行病学分析。RAPD方法和HVR-PCR方法对MRSA的分型率都比较高，都达到了100%，而且这两种方法都比较简单、稳定、可靠、快速，可以在短时间内对MRSA进行分型。研究中还发现这两种方法之间没有很好的相关性，即相同的RAPD型可以表现出不同的HVR-PCR型;反之，相同的HVR-PCR型也可以呈现出不同的RAPD型。