AngⅡ对腹膜间皮细胞ROS和NADPH氧化酶亚基p47phox表达的影响及黄芪的干预作用

　1材料与方法

　　1.1主要试剂胎牛血清(FBS)、DMEM/F12干粉培养基(GIBCO公司);胰蛋白酶(Amerasco公司);AngiotensinⅡ(Sigma, USA);黄芪注射液(正大青春宝药业有限公司生产，国药准字Z33020179，每支10mL相当于原材料20g);H2-DCFDA(Molecular Probes, USA);Trizol试剂(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Fermentas公司);Taq DNA聚合酶(Fermentas公司);RNase抑制剂(GIBCO BRL公司);焦碳酸二乙酯(DEPC，博彩公司);DNA Marker(DL2000，TaKaRa公司);琼脂糖(Biolabs公司);兔抗大鼠p47phox抗体(Upstate公司，USA);兔抗大鼠GAPDH抗体(Dako公司，Denmark);BCA法蛋白浓度测定试剂盒(Pierce公司);TEMED(Sigma公司)，其余化学试剂为国产分析纯。

　　1.2大鼠腹膜间皮细胞的分离与培养[8]健康清洁级雄性SD大鼠，会计论文发表体重180～220g，由河南科技大学机能实验中心提供，每只肌肉注射100mL/L水合氯醛约0.6～1.0mL。待麻醉后向大鼠腹腔内注射20～30mL 2.5g/L胰蛋白酶+0.2g/L EDTA消化液。2h后断颈处死大鼠，750mL/L酒精全身浸泡消毒5min。将大鼠仰面放置于超净工作台上，沿腹白线依次剪开腹壁皮肤及肌肉，吸出腹腔内液体，移入15mL离心管中。1500r/min离心15min，弃上清，加入含100mL/L FBS的DMEM/F12培养液，轻轻用吸管吹打使之成为细胞混悬液，分装于25cm2的细胞培养瓶中。 再加入培养基使之总体积达到4～5mL，放入条件为37℃、950mL/L空气、50mL/L CO2的细胞培养箱中培养。每3d更换一次培养基。免疫组织化学方法鉴定结果示细胞角蛋白(cytokeratin)阳性，将2代腹膜细胞随机分为以下4组：正常对照组，AngⅡ(10-7mol/L)刺激组，两组用无血清的DMEM/F12培养基培养;黄芪注射液高浓度(2g/mL)干预组，黄芪注射液低浓度(1g/mL)干预组，两组提前孵育1h进行干预处理。在合适的时间点，观察以上各组各指标的变化情况。

　　1.3细胞内ROS的测定ROS的测定按文献报道方法[9]。具体如下：将细胞传至激光共聚焦专用培养皿(Corning公司)，静止24h同步化后，KRH缓冲液清洗3次，将各组细胞用10mg/L H2-DCFDA避光孵育37℃ 15min，KRH缓冲液再清洗3次，激光共聚焦显微镜观察，激发波长488nm，发散波长505nm，摄像。测定各组荧光强度值，并以对照组荧光强度为基线，计算其他各实验组相对荧光强度值。

　　1.4实时定量RT-PCR检测总RNA提取按照Trizol试剂说明书操作。取2μg总RNA按反转录试剂盒说明书合成cDNA。用实时定量PCR仪(美国MJResearch)检测mRNA的表达。定量PCR反应体系：SYBR Green Mix 7.5μL，引物各0.3μL，cDNA 1.0μL，加三蒸水补足至15μL。反应条件：94℃预变性5min，92℃变性15s，60℃退火并延伸1min，共40循环，72℃终末延伸10min。PCR产物于12g/L琼脂糖凝胶电泳FluorechemTM8900凝胶成像系统成像，以目的基因与内参照GAPDH积分吸光度的比值作为定量值进行统计分析。引物序列见表1。表1实时定量PCR的引物序列Tab.1Primers for RTQ-PCR基 因引物序列产物长度

　　1.5Western印迹

　　按文献报道方法[11]。取各组细胞，PBS洗2遍，加入细胞裂解液，收获蛋白质，4℃，12000r/min，离心15min，Bradford法测定浓度。取适量的蛋白质标本，100g/L丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶上电泳，电压90V 30min，140V 60min。室温恒压100V维持90min。丽春红染色硝酸素纤维膜，观察蛋白转移结果。TBST洗膜：室温下10min。50g/L脱脂奶粉阻断：室温下轻摇60min。TBST洗膜：室温下10min×3次。抗原抗体免疫反应加入TBST稀释的p47phox(1∶500)或GAPDH(1∶1000)抗体孵育：4℃摇床轻摇过夜。TBST洗膜：室温下10min×3次。分别与辣根过氧化物共轭的抗-兔的Ⅱ抗(1∶1000)及HRP-anti-biotin抗体(1∶1000)室温下孵育1h。TBST洗膜：室温下10min×3次。显影、检测ECL发光。室温下将膜浸于发光剂中1min后，取出膜甩去多余液体，将硝酸素纤维膜置于两张干净的保鲜膜之间，在暗室中对着X-线胶片曝光0.5～30min不等。胶片投入自动洗片机中冲洗和烤干。于凝胶成像系统进行目的蛋白及内参照GAPDH条带灰度分析。

　　1.6统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行分析。吸光度分析采用单位面积计算机图像扫描值减去背景值的均值表示信号强度，以GAPDH作为内参照，计算两者吸光度的比值，并以对照组或0h组作为基准，计算其他各实验组相对吸光度值，以±s表示。组间比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

　　2结果会计论文发表

　　2.1大鼠腹膜间皮细胞的鉴定培养的大鼠腹膜间皮细胞呈菱形、椭圆形、多边形等，细胞融合后，呈典型的铺路石样。免疫组化结果示细胞角蛋白(cytokeratin)阳性。在AngⅡ10-7mol/L浓度作用12h后，RPMCs失去原来的整齐排列，细胞间隙增宽，但细胞形态未出现明显的改变(图1)。图1腹膜间皮细胞的形态Fig.1 Morphology of peritoneal mesothelial cells (×200)A：正常大鼠腹膜间皮细胞的形态;B：血管紧张素Ⅱ刺激后大鼠腹膜间皮细胞的形态。

　　2.2AngⅡ对ROS产生的影响及黄芪的干预作用激光共聚焦显微镜观察DCF荧光强度代表ROS产生的量。正常对照组(A组)，AngⅡ(10-7mol/L)组(B组)，AngⅡ+AGI(2g/mL)组(C组)，AngⅡ+AGI(1g/mL)组(D组)，在DCF孵育20min后，ROS的产生情况如图所示(图2)。统计学分析，腹膜间皮细胞经AngⅡ刺激20min后，ROS产生较A组显著增加(P<0.05)。C组、D组均可显著逆转由AngⅡ刺激诱导的ROS产生增加，与B组比较，均差异显著(P<0.05)。C组与D组相比较差异显著(P<0.05)，说明ROS产生的量与AGI的浓度呈负相关(图3)。图2激光共聚焦显微镜DCF荧光Fig.2 DCF fluorescent model under laser confocal microscopeA：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)。图3AngⅡ对ROS产生的影响及黄芪的干预作用Fig.3 Angiotensin Ⅱ influenced ROS production and effect of astragalus intervention (n=4)A：正常对照组;B：AngⅡ(10-7mol/L)组;C：AngⅡ+AGI(2g/mL)组;D：AngⅡ+AGI(1g/mL)组。A vs. B，P<0.05;B vs. C，P<0.05;B vs. D，P<0.05;C vs. D, P<0.05。