摘要：丹皮酚磺酸钠注射液具有较好的抗菌消炎、镇痛消肿作用，临床用于治疗关节酸痛、颈椎腰椎增生等病症。前期，南京金陵制药厂就丹皮酚磺酸钠（原料）的细菌内毒素检查法进行了方法学验证，并确立了检查方法。本次丹皮酚磺酸钠注射液细菌内毒素检查法方法学验证的试验设计是以《中国药典2015 版》（第四部）附录中细菌内毒素凝胶检查法的要求，以及金陵制药厂对丹皮酚磺酸钠（原料）细菌内毒素检查方法的操作规程为依据，通过干扰试验确定最大不干扰浓度，并进行方法学验证。结果表明，丹皮酚磺酸钠注射液质量浓度不超过0.83mg/ml 时对细菌内毒素检查无干扰。
关键词：丹皮酚磺酸钠注射液；细菌内毒素；鲎试剂；干扰试验；方法学验证
中图分类号：R927文献标识码：A文章编号：1671-5837(2018)06-0238-04
The Methodology Validation of Bacterial Endotoxin Text for Paeononlsilatie Sodium Injection
YuanQingfeng Hujiong
Jinling Pharmaceutical Co., Ltd.. Nanjing Jinling Pharmaceutical Factory,Jiangsu Nanjing 210000
Abstract: Paeononlsilatie Sodium Injection has good functions of anti-inflammation ,abirritation and detumescence . It can be applied in clinic for treatment of conditionslike arthralgia and lumbar hyperplasia . Nanjing Jinling pharmaceutical factory has validated the methodology of bacterial endotoxin test for sodium paeonol sulfonate ( raw material ) , and the inspection method has been established . The experiment design of this methodology validation of bacterial endotoxin test for paeononlsilatie sodium injection is based on the requirements of bacterial endotoxin test stated in appendix Ⅳof Chinese Pharmacopeia ( 2015 edition ) and the operating procedures of bacterial endotoxin test for sodium paeonol sulfonate ( raw material ) which is formulated by Jinling Pharmaceutical Factory . The maximum non-interference concentration of samples was determined by interference test , and then methodology validation was conducted . The result is that the interference of tachypleus amebocyte lysate ( TAL ) on bacterial endotoxin test can be excluded when Paeononlsilatie sodium injection was diluted to below 0.83mg/ml.
Keywords:Paeononlsilatie sodium injection ; Bacterial endotoxin ; Tachypleus amebocyte lysate ; Interference test ; Methodology validation
引言
《中国药典2015 版》规定，注射剂应进行细菌内毒素检查或热原检查。丹皮酚磺酸钠注射液是消炎止痛的良药，但其作为注射剂，目前尚无内毒素检查的国家统一标准，在进行细菌内毒素检测时质量标准变数较大，不利于质量管理。
南京金陵制药厂对丹皮酚磺酸钠（原料）的细菌内毒素检查有着明确的企业操作规程以及内控标准，确立了完善的丹皮酚磺酸钠（原料）细菌内毒素检查法，并通过了方法学验证。但是，原料细菌内毒素检查合格并不能代表该注射剂的内毒素也达到要求，辅料如依地酸二钠、亚硫酸氢钠以及甘油当中的细菌内毒素，注射剂生产过程中的一系列不确定因素，这些都有可能使得注射液成品细菌内毒素检查不合格。
本试验旨在依据《中国药典2015 版》（第四部）通则1143 细菌内毒素凝胶检查法和应用指导原则，以及金陵制药厂关于丹皮酚磺酸钠细菌内毒素检查的企业内控标准，确定丹皮酚磺酸钠注射液的内毒素限值，用不同厂家不同批次鲎试剂对多批次丹皮酚磺酸钠注射液样品进行干扰试验，以确定丹皮酚磺酸钠注射液建立细菌内毒素检查法的适用条件，即确定内毒素限值、最大无干扰浓度、最大稀释倍数及稀释浓度范围等，最终确认检验条件，并进行方法学验证，可作为产品检查方法。
1实验准备
1.1 实验仪器及试药
1.1.1 仪器
WH-3 型漩涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；DH100-2 型干式恒温器（杭州瑞诚仪器有限公司）；ZH-2 型漩涡震荡仪（天津药典标准仪器制造厂）；BCW-1000A型净化台（苏州净化设备有限公司）；GZX-9246MBE 型数显鼓风干燥箱（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；微量取样器（上海求精生化试剂仪器有限公司，规格：100-1000μl）；试管架；镊子；砂轮；酒精棉；保鲜膜等。
1.1.2 药品与试剂
（1）鲎试剂：简称TAL。湛江安度斯生物有限公司，批号：1506251、1512142，标示灵敏度（λ）：0.25EU/ml，规格：0.1EU/支。博康海洋生物有限公司，批号：1503120、1512070，标示灵敏度（λ）：0.25EU/ml，规格：0.1EU/支。
（2）细菌内毒素工作标准品：简称CES，中国食品药品检定研究院，批号：150601-201580，效价：80EU/支。
（3）细菌内毒素检查用水：简称BET 水，湛江博康海洋生物公司，批号：1504200。
（4）丹皮酚磺酸钠注射液：金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，批号：151101、160101、160401，规格：2ml：100mg。
1.2 器具处理
试验中所需全部玻璃器皿均需进行前处理，以除去所有可能存在的外源性细菌内毒素。
首先用洗涤剂和自来水洗净，晾干水分后置洗液中浸泡4 个小时，取出，用自来水将残留的洗涤剂洗净，再用蒸馏水冲洗至少3 遍，置250℃烤箱中恒温60分钟，除去外源性内毒素，密封备用。注意，在清洗玻璃器皿的过程中，禁止使用纯化水冲洗，以避免实验误差[12]。
1.3 内毒素工作标准品溶液的制备
本次验证试验所用的内毒素标准品来自中国食品药品检定研究院，效价均为80EU/支。每一验证试验环节所用内毒素标准品溶液均现配现用，配制方法如下：中国科技期刊数据库 医药
2018 年 6 月 239
取含量为80EU/支的细菌内毒素工作标准品1 支，用75％酒精棉球擦拭瓶口，置净化台通风处吹干后轻轻开启。按照细菌工作标准品说明书，向其中加入1ml细菌内毒素检查用水使之溶解，置漩涡混合仪混匀15 分钟，得到80EU/ml 的细菌内毒素标准溶液，稀释制备浓度分别为2λ、λ、0.5λ以及0.25λ即0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.625EU/ml 四个浓度的内毒素标准品溶液，每稀释一步，均需在漩涡混合仪上混匀30 秒，用封口膜密封，静置备用。
1.4 鲎试剂的准备
根据每步验证过程，选择相应数量、批号的鲎试剂，按如下操作方法进行鲎试剂的准备工作：
取一定数量的鲎试剂，轻弹安瓿瓶身，使鲎试剂粉末落入瓶底，用砂轮在安瓿瓶口处打磨以防玻璃渣掉入安瓿瓶中。用75％酒精棉球擦拭瓶口处，在净化台通风口处吹干后轻轻掰开安瓿瓶，使用前各加入1ml 内毒素检查用水复溶，置小试管架上备用。
1.5 丹皮酚磺酸钠注射液细菌内毒素限值（L）的计算确定
丹皮酚磺酸钠注射液的规格为2ml：0.1g（以C9N9NaO6S计），临床用法用量为肌内注射，一次0.1-0.2g（1-2支），一日1-2次，因此每次最大剂量为0.2g[5]。根据公式L=K/M，K=5EU/(kg·h)，M=200mg/(60kg×1h)=6.67mg/(kg·h)计算可得，L=1.5EU/mg。
1.6 最大有效稀释倍数（MVD）或最小有效稀释浓度（MVC）的确定
根据丹皮酚磺酸钠注射液药品说明书，质量浓度c=50mg/ml。选取灵敏度为0.25EU/支的鲎试剂进行检测，内毒素限值L=1.5EU/mg，则丹皮酚磺酸钠注射液最大有效稀释倍数MVD=cL/λ=50mg/ml×1.5EU/mg÷0.25EU/ml=300，即供试品需在稀释倍数小于300倍的情况下进行细菌内毒素检查。
2验证方案过程与结果
2.1 鲎试剂灵敏度复核
2.1.1 加样方法与步骤
取待复核的鲎试剂原安瓿瓶18 支/批，将其摆放为5 列，前4 列每列4 支，第5 列2 支，分别加入1ml内毒素检查用水复溶，然后从左至右依次加入1ml内毒素标准品溶液，每一浓度平行4 支为一列，向最后一列鲎试剂中分别加入1ml 的内毒素检查用水作阴性对照。
加样完毕后，用封口膜密封鲎试剂，轻轻转动瓶身混匀，除去气泡，垂直放入37℃±1℃干式恒温器中，保温60 分钟±2 分钟。
保温结束后，用镊子将鲎试剂瓶轻轻取出，避免震荡，取出后将瓶身倒转，若管内形成凝胶，且凝胶不变形、不滑脱，则为阳性，记录为（+）；若未形成凝胶或者形成的凝胶变形滑脱，则为阴性，记录为（-）。
保温和拿取试管的过程中，应避免振动而导致假阴性结果。
2.1.2 复核试验现象记录与结果分析
此次鲎试剂复核试验中，内毒素最大浓度2λ平行管均为阳性，且最小浓度0.25λ平行管与阴性对照管均为阴性，说明复核试验是有效的。
反应终点浓度λc 即鲎试剂灵敏度的测定值λc=lg-1(∑X/4)，其中X 为反应终点浓度，则两个厂家四个批号的鲎试剂灵敏度测定值分别为：
λc（1506251）=lg-1[(lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4]=0.25EU/ml；
λc（1512142）=lg-1[(lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4]=0.25EU/ml；
λc（1503120）=lg-1[(lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4]=0.25EU/ml；
λc（1512070）=lg-1[(lg0.25+lg0.25+lg0.25+lg0.25)/4]=0.25EU/ml。
由计算结果可知，四个批号的鲎试剂灵敏度测定值0.25EU/ml 均大于0.125EU/ml 且小于0.5EU/ml，即0.5λ≤λc≤2λ，则均可用于细菌内毒素检查，以标示灵敏度0.25EU/ml 作为该批次鲎试剂的灵敏度。
2.2 干扰试验预试验
2.2.1 试验溶液准备
（1）供试品阴性对照溶液的制备
取三个批号的丹皮酚磺酸钠注射液各一支，用75％的酒精棉球擦拭安瓿瓶口，置净化台通风口吹干后轻轻掰开，用细菌内毒素检查用水进行不大于最大稀释倍数150 倍的稀释。本次试验拟采用以下稀释方案进行预试验。
分别用内毒素检查用水稀释10、30、60、120、150 倍，即稀释至质量浓度分别为5.00mg/ml、1.67mg/ml、0.83mg/ml、0.42mg/ml、0.33mg/ml 的稀释液待测，此系列浓度样品及以及原液成为供试品阴性对照溶液，记为NPC 系列。
（2）供试品阳性对照溶液的制备
分别取浓度为待制备浓度两倍的样品溶液，与浓度为4λ即0.1EU/ml 的内毒素标准溶液等体积混合。向供试品原液中加入体积小于0.01ml 浓度为0.50EU/ml 的内毒素标准品溶液，可得与供试品原液相对应的供试品阳性对照溶液，此系列溶液称为供试品阳性对照溶液，记为PPC 系列。
（3）阳性与阴性对照溶液的制备
用浓度为2λ即0.5EU/ml 的内毒素标准溶液配制一组阳性对照溶液，记为PC；用内毒素检查用水作为一组阴性对照溶液，记为NC。
2.2.2 预试验现象记录及结果分析
阴性对照NC 系列均为阴性，阳性对照PC 系列均为阳性，则试验有效。在NPC 与PPC 系列中，稀释倍数为60 倍时，阴性对照平行管均为阴性，且阳性对照平行管均为阳性，此时供试品溶液浓度为0.83mg/ml，则丹皮酚磺酸钠注射液进行细菌内毒素检查时的最大不干扰浓度为0.83mg/ml，即当其浓度低于0.83mg/ml 时，对这两个厂家的鲎试剂（λ=0.25EU/ml）均未见干扰。
2.3 正式干扰试验
根据预试验结果，制定并实施正式干扰试验方案，以确定丹皮酚磺酸钠注射液最大不干扰浓度。
2.3.1 正式干扰试验溶液准备
（1）供试品溶液:
取三个批次的丹皮酚磺酸钠注射液各一支，用内毒素检查用水稀释至预试验中确定的最大不干扰浓度，即0.83mg/ml，密封备用。
