灵芝活性多糖的提取工艺研究

【摘要】  目的 确立水提醇沉法与超声提取法相结合提取灵芝活性多糖的最佳工艺。方法 以脾细胞代谢MTT活力为评价指标，采用正交试验对超声时间、水提温度和水提时间等因素进行考察，寻求最佳的提取工艺。结果 各因素对灵芝多糖脾细胞代谢MTT活力的影响大小排列为: 超声时间>水提温度>水提时间,超声时间对灵芝多糖活性影响显著。提取最佳工艺为：超声提取时间20 min，水提取温度80 ℃，水提取时间2 h。结论 本工艺为提取活性灵芝多糖提供了一定的参考。

【关键词】  灵芝多糖;脾细胞;提取工艺;正交试验

Abstract:Objective To explore an optimum extraction procedure(water extraction–alcohol precipitation and ultrasonic extraction method) of active polysaccharides from Ganoderma lucidum.Methods By using colorimetric methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay of splenic cells of mice as evaluation indicator,orthogonal test was conducted to evaluate ultrasonic extraction time,water extraction temperature,and water extraction time to explore the optimal extraction procedure.Results The main influencing factors of colorimetric methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay of splenic cells of mice were ultrasonic extraction time，water extraction temperature，and water extraction time in turn. The optimal conditions of orthogonal experiment：ultrasonic extraction for 20 minutes,water extraction at 80 ℃ for 2 hours. Ultrasonic extraction time had significant effect on extraction of active polysaccharides from Ganoderma lucidum.Conclusion The technology provided references for extraction of active polysaccharides from Ganoderma lucidum.

　　Key words:Ganoderma lucidum polysaccharides;splenic cells;extraction procedure;orthogonal experiments

　灵芝是我国传统的补益中药，现代研究表明灵芝多糖是其主要活性成分之一，灵芝多糖具有抗肿瘤及免疫调节作用[1，2]。灵芝多糖提取方法有传统的水提醇沉法[3，4]、超声波法[4-6]、酶法，还有冷冻预处理法、超声波催化纤维素酶法、超临界萃取法等。灵芝多糖的活性在不同的提取工艺中变化很大，提取率高并不意味其有效活性高。现有文献对灵芝多糖提取工艺的研究未与其活性联系起来。本文拟采用水提醇沉法和超声波法相结合提取灵芝活性多糖，应用正交试验法设计试验，探讨提取工艺中影响因素对多糖活性的影响，采用小鼠脾细胞增殖实验检测多糖的免疫活性，确立优化的提取工艺。

　　1 实验材料

　　1.1 动物

　　SPF级近交系BALB/c小鼠，雌雄兼用，8～10周龄，体质量(20±2)g，由南方医科大学实验动物中心提供，证号：SCXK(粤)2006?0015。

　　1.2 材料

　　灵芝(产地：广西，批号：20080101，广州市药材公司中药饮片厂)。

　　1.3 仪器

　　LIBROR AEG?220G型电子天平(SHIMADZU Corporation);超声仪(广州华南超声设备厂);恒温水浴器(汕头市医用设备厂有限公司);RE?52A型旋转蒸发仪(上海雅荣生化设备仪器有限公司);D1?2SA型鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司);DOA?P133A?B8型抽滤减压泵(Gast Manufacturing,Inc.);ST?21型高速冷冻离心机(美国杜邦公司);Universal 16A型低速离心机(Hettich公司);Benchmark PlusTM型连续波长酶标仪(Bio?RAD公司);5410型CO2培养箱(Thermo 公司)。

　　1.4 试剂

　　95%乙醇(广东广宁县葡萄糖药业有限公司，批号：20071101);葡萄糖、硫酸等试剂均为分析纯;重蒸苯酚(南方医科大学化学教研室);RPMI 1640培养基(GIBCO公司产品);噻唑兰(MTT)、Con A(刀豆蛋白A)均为Sigma公司产品。

　　2 方法

　　2.1 正交试验设计

　　根据文献报道，超声提取时间(因素A)、水提取温度(因素B)、水提取时间(因素C)对灵芝多糖的提取影响较大，最佳的提取条件在一定范围之内，超声时间为20～40 min，提取时间为1.5～3 h，提取温度为80～100 ℃[6-8]。根据预实验及文献，本文正交试验对上述三因素，每个因素设三水平进行考察，以脾细胞代谢MTT活力作为考察指标。根据正交试验的综合评分选择最佳方案。正交设计选用L9(34)正交表，见表1。

　　2.2 提取方法

　　精密称取灵芝粉50 g置圆底烧瓶中，加入10倍量乙醇， 70 ℃水浴回流30 min作预处理，过滤，滤渣置圆底烧瓶中，加入15倍量水后按照正交水平表进行试验，先进行超声(因素A)处理，超声完成后，放入恒温水浴器内，按照提取温度(因素B)和时间(因素C)条件的三水平平行操作，水提完成后过滤，滤液于2～10 ℃冷藏放置过夜，抽滤，滤液减压浓缩至约100 mL，加入3倍量乙醇，2～10 ℃冷藏放置过夜，抽滤，沉淀用100 mL热水溶解，水浴蒸至稍干后60 ℃恒温干燥，得水溶性粗多糖，精密称量后计算多糖提取率和含量。表1 正交试验的因素水平表

　　2.3 多糖的测定

　　灵芝多糖的测定采用苯酚?硫酸比色法，以葡萄糖为标准品。

　　2.4 脾细胞代谢MTT活力测定

　　取健康BALB/c小鼠，脱颈椎处死，无菌取出脾脏，常规制备脾细胞悬液,用含10%新生牛血清RPMI 1640 培养液(以下简称全培)调整细胞浓度为8×106个/mL ,在已加好待测样品或者对照试剂的96孔板中每孔加入上述细胞悬液100 μL。使总体积为200 μL，置培养箱中在饱和湿度、5%CO2、37 ℃条件下培养48 h。

　　小鼠脾细胞培养结束前4 h，每孔加入0.25%MTT(生理盐水配制)20 μL，继续培养4 h，然后每孔加二甲基亚砜100 μL，振摇2 min使MT′T的紫色还原产物完全溶解。最后用酶标仪在570 nm处测定光密度，结果用570 nm处的吸光度值(A)表示。

　　2.5 统计分析

　　采用SPSS 13.0统计软件中的正交设计方差分析法对数据进行统计分析。
3 结 果

　　正交试验结果见表2～3。从表2中脾细胞代谢MTT活力极差(R)可知，影响因素主次顺序为A> B>C，各因素的最佳水平分别为A∶1>2>3，B∶1>2>3，C∶2>1>3;从表3方差分析结果可见，除A因素对脾细胞代谢MTT活力有显著性影响外，其他因素均无显著性影响。综合以上结果，确定最佳提取工艺为A1B1C2，即超声提取时间20 min，水提取温度80 ℃，水提取时间2 h。表2 正交试验结果表3 方差分析(依据多糖脾细胞代谢MTT活力)

　　4 讨 论

　　4.1 本文采用水提醇沉法?超声提取法作为灵芝活性多糖的提取工艺，两种方法结合显著减少水提时间和次数，减少对多糖活性的破坏，多糖含量比文献报道[3，4，6，9]的结果有显著提高。

　　4.2 超声20 min的脾细胞代谢MTT活力比30 min和40 min的高。原因是超声波具有较强的机械剪切作用，长时间作用使多糖结构破坏，导致多糖活性下降。另外，超声时间过长，细胞进一步破碎，杂质溶出去杂质时造成多糖损失，这也是多糖提取率有所下降的原因之一。

　　4.3 水提时间2 h的脾细胞代谢MTT活力比1 h和3 h的高;水提温度80 ℃的脾细胞代谢MTT活力比90 ℃和100 ℃的高。原因是提取时间增加，促进细胞的多糖物质向外扩散，但随着时间和温度进一步增加，细胞破碎程度过大，长时间热水提取，多糖分子容易受热分解，使多糖活性有所下降。

　　4.4 有文献报道有关灵芝多糖有水不溶性多糖、水溶性多糖、酸性多糖、碱性多糖等[10，11]。本文的提取工艺可能使一部分多糖，如水不溶性多糖，在乙醇的预处理和热水提取后加入乙醇沉淀的过程中被弃去，得到的主要是水溶性多糖，因此这可能是本文实验中的灵芝多糖提取率比文献报道[8，10]要低的原因之一。

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