永泰芙蓉李总多糖的分离分析

【摘要】  目的 分离纯化芙蓉李中的总多糖并建立其含量测定方法。 方法 采用水提醇沉法从芙蓉李果实中提取多糖，用大孔吸附树脂、Sevag法等技术纯化多糖，采用纸色谱法鉴别多糖中单糖的种类;以多糖含量为指标，苯酚-硫酸法为测定方法，采用正交试验法优选最佳测定条件。结果 芙蓉李粗多糖提纯物中多糖平均含量为50.86%，苯酚和硫酸的用量、反应温度等对含量测定结果有显著影响，而反应时间的影响较小，方法平均回收率为99.38%，RSD为1.61%(n=6)。结论 首次从芙蓉李中提取得到粗多糖;所建立的含量测定方法准确、可靠，可作为其质量控制的方法。

【关键词】  芙蓉李;多糖;苯酚?硫酸法;含量测定

Abstract:Objective To isolate，purify the total polysaccharides and to establish a method for assay of polysaccharides in Furong plum.Methods Polysaccharides were extracted from Furong plum by water extraction?alcohol?precipitation method,purified by macroporous adsorption resin and Sevag method ,monosaccharides in polysaccharides of Furong plum were identified by paper chromatography. The content of the polysaccharide was determinated by phenol?sulfuric acid method. Orthogonal test was conducted to select the optimal conditions for the determination of polysaccharide. Results Volumes of phonel and sulfuric acid,and reaction temperature had significant effects on determination results,and reaction time had no significant effect on determination results. The average contents of polysaccharides extracted from crude polysaccharides prepared from Furong plum was 50.86%. The recovery rate was 99. 38 % with 1.61 % of RSD (n=6). Conclusion Crude polysaccharides were extracted from Furong plum,and quantified by phenol?sulfuric acid method.The method is accurate,stable,and applicable in the determination of polysaccharides in Furong plum. The methods might be used in the quanlity control the polysaccharides in Furong plum.

　　Key words:Furong plum;polysaccharides;phenol?sulfuric acid method;assay

　 芙蓉李(Prunus salicina Lindl. cv. Furong)为蔷薇科(Rosaceae)李属(Prunus)植物李的果实，始载于《滇南本草》，又名夫人李、浦李、李实。主产于福建永泰县梧桐乡，有430多年的栽培历史，是福建省李树的主栽品种，其中尤以福建永泰芙蓉李道地。李子性甘、酸、苦、平，入肝、脾、肾三经，具有健胃消食的功效;其中所含活性成分具有降气导滞、清肝涤热、生津利水的功能;中医用于治疗肝虚有热、虚劳骨蒸、胃阴不足而致的口中干渴以及腹水等症[1，2]。经课题组前期研究表明，芙蓉李中含有黄酮及其苷类成分、多糖类成分、有机酸类成分、多酚类等成分[3]。多糖广泛存在于自然界，具有多种生物活性，包括免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗辐射、抗菌、抗病毒、保护肝脏等[4、5]。目前国内外已有关于欧洲李果实中多酚及多酚抗氧化作用的研究报道[ 6、7 ] ，未见有关永泰芙蓉李果实中多糖的研究，为了开发利用这一植物资源，笔者对芙蓉李中多糖进行了分离纯化并鉴别其中单糖的种类，运用正交设计实验对多糖含量测定方法的条件进行了考察，并对其含量进行了测定。

　　1 仪器与试药

　　1.1 仪器

　　UV?9100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司);RE?52旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);4802型紫外可见分光光度计(龙尼柯上海仪器有限公司);OHAUS 2140电子分析天平(梅特勒?托利多仪器上海有限公司)。

　　1.2 试药

　　芙蓉李(产地福建永泰，福建中医学院中药鉴定教研室范世明高级实验师鉴定);无水?D?葡萄糖(中国药品生物制品检定所，110833?200503);D?葡萄糖、D?半乳糖、D?果糖、D?甘露糖(国药集团化学试剂有限公司);AB?8大孔吸附树脂(型号D101，天津市光复精细化工研究所);乙醇、苯酚、硫酸、苯胺、邻苯二甲酸等试剂均为分析纯。

　　2 方法与结果

　　2.1 永泰芙蓉李粗多糖的提取分离

　　称取芙蓉李果1 000 g，剪碎，加沸水约2 000 mL，反复提取3次，每次1 h，滤过，收集、合并提取液，浓缩，得芙蓉李粗多糖提取液。

　　2.2 芙蓉李粗多糖的纯化

　　2.2.1 大孔吸附树脂的预处理 称取大孔吸附树脂1 000 g，用体积分数95%乙醇浸泡24 h充分溶胀，装柱后不断用体积分数95%乙醇洗脱至流出液加水(1∶5)不浑浊，改用大量蒸馏水冲洗，洗至无醇味为止，蒸馏水浸泡备用。

　　2.2.2 芙蓉李多糖的纯化 称取处理好的大孔吸附树脂100 g，湿法上柱。精密吸取芙蓉李提取液100 mL上柱。静置，吸附一段时间后，用蒸馏水洗脱，至洗脱液对Molish反应呈阴性。收集洗脱液，浓缩。浓缩液加乙醇使醇含量达80%，静置24 h，抽滤，滤渣依次用无水乙醇、丙酮洗涤，得到粗多糖。将粗多糖溶于水，用Sevag法除蛋白[8，9]，反复进行3次至无蛋白吸收峰。多糖溶液经再次醇沉，静置，得浅紫色絮状沉淀，收集沉淀，抽滤，真空干燥，即得浅灰紫色芙蓉李多糖半纯品无定形粉末。
2.3 芙蓉李多糖中单糖组成的初步分析

　　2.3.1 供试品溶液的制备 取多糖半纯品0.020 g，置10 mL的安瓿瓶中，加入1 mol/L硫酸5 mL，封瓶，100 ℃酸水解8 h，水解液用碳酸钡中和，滤过，滤液浓缩后供纸色谱点样用。

　　2.3.2 对照品溶液的制备 分别取D?甘露糖、D?果糖、D?半乳糖、D?葡萄糖等各2.0 mg，置1 mL量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，供点样用。

　　2.3.3 纸色谱分析 将多糖酸水解供试品溶液、各单糖对照品溶液分别点样于新华1号中速层析滤纸上，用正丁醇?乙酸乙酯?异丙醇?乙酸?吡啶?水(体积比7∶25∶12∶7∶6∶5)为展开剂，展开，取出，晾干。以苯胺?邻苯二甲酸显色，105 ℃烘烤10 min 。结果显示芙蓉李多糖水解供试液在葡萄糖斑点出现的相应位置有相同的红棕色斑点出现。

　　2.4 芙蓉李多糖的含量测定

　　2.4.1 对照品溶液的制备 精密称取105 ℃干燥至恒重的无水D?葡萄糖对照品0.0510 g，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含0.510 mg的葡萄糖对照品贮备液。精密量取对照品贮备液2.0 mL，分别置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含0.0204 mg的对照品溶液。

　　2.4.2 供试品溶液的制备 称取干燥至恒重的芙蓉李粗多糖半纯品约0.020 g，精密称定，用少量热水溶解，定量转移至25 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液4 mL，置50 mL的量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

　　2.4.3 测定波长的选择 精密量取对照品溶液和供试品溶液各2 mL，按“标准曲线”项下同法操作，在400～600 nm波长范围扫描，结果显示对照品和芙蓉李多糖在490 nm波长处有最大吸收。吸收光谱见图2。

　　2.4.4 分析条件的选择 取供试品溶液，按“含量测定”项下同法操作，以苯酚用量、硫酸用量、反应时间和水浴温度为考察因素[10]，采用L9(34)正交设计试验，分别测定吸光度，选择最佳分析实验条件。因素与水平及试验结果见表1～3。表1 因素水平表表2 正交试验结果表3 苯酚?硫酸法测定多糖显色因素方差分析

　　F0.05(2,18)=3.55,F0.01(2，18)=6.01 由直观分析及方差分析结果可知，各因素对多糖含量影响大小顺序为 A>B>D>C，即苯酚用量>浓硫酸用量>反应温度>反应时间;苯酚用量、浓硫酸用量对多糖含量的影响具有极显著性(P<0.01),反应温度的影响也有显著性(P<0.05)，反应时间的影响则没有显著性。综合以上结果，确定苯酚-硫酸法最佳分析反应条件为A1B2C1D1，即5%苯酚1.2 mL，硫酸7.0 mL，反应时间16 min，反应温度80 ℃。

　　2.4.5 标准曲线的制备 精密量取对照品贮备液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别精密量取各溶液2.0 mL，置具塞试管中，分别加苯酚1.2 mL，摇匀，迅速加入浓硫酸7.0 mL，混匀，放置6 min，80 ℃水浴加热5 min，取出后冰水浴中放置5 min，静置10 min，以0号为空白，在490 nm的波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量浓度(μg/mL)为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=0.05C+0.1315，r=0.999 5，表明葡萄糖在2～10 μg/mL的线性范围内呈良好的线形关系。

　　2.4.6 精密度试验 分别精密吸取供试品溶液6份，按“2.4.10”项下同法连续操作，RSD为0.97%。

　　2.4.7 重复性试验 分别精密称取同一批干燥至恒重的永泰芙蓉李多糖半纯品6份，按“2.4.10”项下同法操作，测定，多糖的平均含量为50.07%，RSD为1.56%。

　　2.4.8 显色稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.4.10”项下同法操作，显色后，每隔5 min测定一次吸光度。结果表明溶液在显色45 min内吸光度稳定。

　　2.4.9 加样回收率试验 分别精密称取同一批干燥至恒重的永泰芙蓉李总多糖半纯品0.010 g 6份，各精密加入葡萄糖对照品贮备液10 mL，按“2.4.2”项制备供试液，按“2.4.10”项下同法操作测定吸光度，计算平均回收率和RSD值。结果见表4表4 加样回收率试验结果

　　2.4.10 含量测定 精密吸取2 mL供试品溶液，置具塞试管中，按“2.4.3”项下同法操作，测定吸光度，代入回归方程计算，平行测定3份。总多糖平均含量50.86%,RSD为1.94%。

　　3 讨 论

　　3.1 永泰芙蓉李总多糖可溶于水，在空气中易吸收水分，故实验之前均需进行干燥处理，并存放于干燥器皿，以免影响实验的准确度。

　　3.2 纯化多糖的方法有多种，本实验通过大孔吸附树脂除去粗多糖中的黄酮类、多酚类等可溶于乙醇的成分，再通过Sevag法除去蛋白，醇沉法分离多糖，达到较好的纯化效果。

　　3.3 采用苯酚?硫酸法测定多糖含量，实验操作中应注意加入的浓硫酸7.0 mL应直接迅速加到溶液表面，加酸后应充分摇匀，至颜色稳定(10 min)后进行测定，实验证明结果在45 min内稳定。

　　3.4 纸色谱初步分析实验结果表明，芙蓉李多糖主要由葡萄糖等组成，芙蓉李多糖的组成结构和生理活性尚有待进一步的深入研究。

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