血浆同型半胱氨酸及其相关酶基因多态性与Alzheimer病的关系

目前，血管相关因素在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）发病中的可能作用受到越来越多的重视，而血浆同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高是动脉粥样硬化性心脑血管病的独立危险因素，因此，高Hcy水平是否参与了AD的发生发展成为目前国内外研究的热点。本文通过对68例AD患者和68例健康对照组的血浆Hcy水平、MTHFR基因 C677T多态性的研究比较，探讨血浆Hcy水平、MTHFR的基因多态性与AD的关系，以期为今后的临床诊断与治疗提供思路。  

    1  对象与方法

    1.1  研究对象  选自2005年9月—2006年10月期间到山西医科大学附属第一医院就诊的AD患者（AD组）和健康体检人群（正常对照组），均为随机选择。（1）AD组68例，其中男 44例，女24例；平均年龄（75.71±8.931）岁。入选标准:以简易精神状态检查量表（MMSE）、日常生活活动能力量表（ADL）初筛存在痴呆，Hachinski缺血评分＜4分，所有患者经脑部影像学检查示脑萎缩、脑室扩大，再根据美国国立神经病语言障碍卒中研究所及阿尔茨海默病和相关疾病学会（NINCDS-ADRDA）的临床诊断标准诊断为临床很可能AD。（2）健康对照组68例，男38例，女30例；平均年龄（73.42±8.300）岁。既往无心脑血管疾病、糖尿病、肝肾疾病、支气管哮喘、慢性阻塞性肺气肿等病史。  AD组和对照组比较，性别和年龄构成差异无显著性，两组研究对象均排除高血压、心脏病、高血脂、糖尿病、周围血管疾病、肾功能不全、药物因素等对血浆Hcy水平的影响，均为山西汉族人，饮食结构相似，且无血缘关系。职称论文发表网

    1.2  研究方法

    1.2.1  血浆Hcy的测定  受检者空腹抽取静脉血3ml，置抗凝管中，于1h内进行离心分离，采用循环酶法测定血浆Hcy水平。

    1.2.2  标本基因组DNA的制备  抽取静脉血2ml，EDTA抗凝，采用低渗溶血，常规酚-氯仿法提取白细胞基因组DNA。

    1.2.3  引物的设计及合成  MTHFR 基因片段扩增引物为：上游5－AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3，下游5-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGG-3，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

    1.2.4  PCR扩增反应  反应体系50μl，引物各10pmol，10mMdNTP 1μl，10×buffer 5μl， DNA3μl，2.5u Taq 聚合酶，反应条件：预变性94℃5min，（94℃30s、58℃40s、72℃1min） 31cycles， 72℃延伸10min。

    1.2.5  RFLP分析  （1）MTHFR基因C677T PCR 产物6μl，Hinf I内切酶10u，10×buffer 2μl，去离子水11μl，混匀后37℃恒温箱内消化过夜。（2）3％琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物：取酶切产物10μl加入3％琼脂糖凝胶负极端的加样孔内，以溴酚兰为指示剂，溴化乙锭为染色剂，在170V电压下电泳1h15min，在紫外线灯下观察带型。
 1.2.6  MTHFR基因型的确定  MTHFR基因片段PCR扩增产物长度为198bp,经Hinf I内切酶酶切后从突变部位裂解成为175bp、23bp两个片段。该基因3％琼脂糖凝胶电泳图谱见图1。

　   1.3  统计学处理  全部数据采用SPSS12.0软件进行统计学处理。t检验比较两组Hcy水平；吻合度检验确定MTHFR基因型分布是否符合Hardy- Weinberg平衡定律，χ2检验比较基因型、等位基因分布频率。职称论文发表网

　　 2  结果

    2.1  AD组与对照组血浆同型半胱氨酸水平比较  AD患者血浆Hcy水平（13.92±5.513）μmol/L显著高于正常对照组（10.83±3.800）μmol/L（t=-3.473,P=0.001）。RR＝1.154，95%可信区间为1.057～1.26（见表1）。表1  AD组和对照组血清同型半胱氨酸水平比较 注：与对照组相比（经t检验），*P=0.001

    2.2  AD组和对照组MTHFR基因型及等位基因频率分布  吻合度检测表明AD组和对照组MTHFR各基因型分布均符合Hardy- Weinberg平衡定律。两组MTHFR基因型分布总体比较差异有显著性（χ2＝6.727，P=0.034），C/T基因型频率在AD组中显著增高，差异有显著性（χ2＝6.654，P=0.01）（见表2）。等位基因分布总体比较差异无显著性。表2  AD组和对照组MTHFR基因型及等位基因频率分布注：与对照组相比，*P<0.05

    3  讨论

　 Hcy是由饮食中摄取的蛋氨酸经脱甲基作用后产生的含硫氨基酸，有两个主要代谢途径：再甲基化和转硫化。再甲基化主要用以维持Hcy的基础水平，而在蛋氨酸过量的情况下或者机体需要合成半胱氨酸时，Hcy就会进入转硫化途径。Hcy的代谢过程涉及到多个酶和辅助因子，相关酶基因突变导致酶活性减低或缺乏是造成血浆Hcy水平升高的重要原因。  目前，血浆高Hcy水平是否参与了AD的发生发展已成为目前国内外研究的热点。Seshadri等［1］以前瞻性研究方法发现血浆Hcy水平升高者发生AD的危险性增高，尤其是>14μmol/L时危险性可增高1倍，从而提出血浆Hcy水平升高是AD的重要独立危险因素，我国毕胜等［2］也研究发现 Hcy水平在AD患者中显著增高。本实验通过对山西汉族人群AD患者和正常对照组血浆Hcy水平的比较，发现AD组血浆Hcy水平显著高于对照组，这一结果与国内外相关研究结果相近。  MTHFR是Hcy再甲基化途径中的一个关键酶，它将5，10亚甲基四氢叶酸不可逆地转化为5-甲基四氢叶酸，从而为Hcy合成蛋氨酸提供甲基团。编码该酶的基因定位于常染色体1p36［3］，cDNA全长22kb。至今已发现导致该酶缺陷的15种突变型，其中以C677T突变多见，即667位胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）取代，从而丙氨酸被缬氨酸取代，导致酶的活性降低，引起高Hcy血症。本试验通过比较AD组和正常对照组的MTHFR基因C677T各基因型、等位基因频率，发现MTHFR 各基因型总体分布在两组之间差异有显著性，AD组中C/T基因型频率显著高于对照组，提示MTHFR基因多态性可能通过对Hcy水平的影响参与了山西汉族人群AD 的发生发展。在我国广州开展的类似研究中，也发现C/T基因型分布在AD组中较高，同时还发现C/C型分布在AD组中较低，而毕胜等［2］在东北地区的研究并未发现MTHFR基因突变与AD相关。在国外， Seripa等［4］同时对从神经病理上确诊的AD患者和临床上诊断为很可能AD患者及相应的对照组进行了该基因多态性的分析，未发现其在病例组和对照组之间有显著差异。可以看出，目前国内外相关研究结果争议较大。造成这些差异的原因可能与多种因素有关，如：样本人群的种族和地区差异、饮食习惯等，因此，需要开展地区性或全国大范围内的类似研究，从而进行有效的、针对性的预防和干预。  本研究证实了血浆Hcy水平在AD患者中显著升高，并且发现AD组MTHFR 基因C677T C/T基因型频率显著高于对照组，由此推测山西汉族AD患者血浆Hcy水平升高有遗传因素的影响，因而为今后临床上干预高Hcy血症及AD的基因诊断、治疗提供了理论依据。职称论文发表网