愈酚甲麻那敏分散片的人体药动学研究

【摘要】  目的 建立测定人血浆中愈创木酚甘油醚的高效液相法，以研究健康志愿者口服愈酚甲麻那敏分散片后愈创木酚甘油醚的药动学过程。方法 色谱条件：Agilent Eclipse XDB?C18为色谱柱，以乙腈?磷酸二氢铵(体积比20∶80,浓磷酸调至pH值3.0)为流动相，氧去甲右美沙芬为内标，紫外检测波长为230 nm。结果 愈创木酚甘油醚质量浓度在25～2 000 ng·mL-1范围内线性关系良好(r=0.997 7)，定量下限为25 ng·mL-1。20名受试者单剂量口服愈酚甲麻那敏分散片后的主要动力学参数Cmax为(474±142)ng·mL-1，tmax为(0.275±0.123)h，t1/2为(0.83±0.55)h，AUC0→4为(451±165)ng·h·mL-1，AUC0→∞为(505±159)ng·h·mL-1。结论 本文所建立的方法简便、准确、可靠，可满足愈创木酚甘油醚临床药动学研究的需要。

【关键词】  愈创木酚甘油醚;药动学;高效液相色谱法;愈酚甲麻那敏分散片

Abstract:Objective To determine the content of guaifenesin in human plasma samples by HPLC and to study its pharmacokinetics. Methods The plasma samples were separated on Agilent Eclipse XDB?C18 column with acetonitrile?ammonium dihydrogen phosphate (20∶80，which was adjusted with phosphoric acid to pH3.0) as mobile phase and as dextrophan as internal standard.The detection wavelength was set at 230 nm. Results The concentration of guaifenesin showed good linearity in the range of 25-2 000 ng·mL-1 (r=0.997 7),with lower limit of quantification at 25 ng·mL-1.The main pharmacokinetic parameters in 20 healthy volunteers after administration of single oral dose of chlorphenamine maleate dispersible tablets were the following：Cmax:(474±142)ng·mL-1，tmax:(0.275±0.123)h，t1/2:(0.83±0.55)h，AUC0→4:(451±165)ng·h·mL-1，AUC0→∞:(505±159)ng·h·mL-1.Conclusion The method was simple，accurate and reliable to use in clinical pharmacokinetic study of guaifenesin.

　　Key words:guaifenesin;pharmacokinetics;HPLC

　 愈酚甲麻那敏分散片是由愈创木酚甘油醚、消旋盐酸甲麻黄碱、马来酸氯苯那敏组成的复方制剂，用于治疗和减轻因感冒、支气管炎等引起的咳嗽、咯痰等症状。关于生物样品中愈创木酚甘油醚浓度的测定方法已有多篇文献报道[1-5]，所采用的方法有高效液相色谱(HPLC)法[1-3]、气相色谱(GC)?电子俘获检测器(ECD)法[4]和HPLC?质谱联用(LC/MS/MS)法[5]。本试验在文献基础上建立一种简单、灵敏和快速的HPLC法，测定愈酚甲麻那敏分散片中愈创木酚甘油醚的血浆浓度，以考察其体内药动学过程。

　　1 材 料

　　1.1 仪器

　　Agilent HP1100系列高效液相色谱仪,包括1100泵系统、1100可调波长紫外检测器、1100工作站(美国安捷伦科学仪器有限公司)。

　　1.2 试药

　　愈创木酚甘油醚对照品，批号：100528?200401，购自中国药品生物制品检定所;氧去甲右美沙芬(内标，由沈阳药科大学药化教研室提供)，含量99.5%;愈酚甲麻那敏分散片由深圳市中联制药有限公司生产，规格：每片含愈创木酚甘油醚100 mg，消旋盐酸甲麻黄碱20 mg，马来酸氯苯那敏2 mg，批号：080719;乙腈为色谱纯;其余试剂均为分析纯;人空白血浆，由中国医科大学附属盛京医院输血科提供。

　　2 方 法

　　2.1 研究对象

　　选择健康男性志愿者20名，平均年龄(22.8±0.91)a，平均体质量(64.65±6.92)kg，试验前经体格检查，心电图、肝、肾功能等各项指标均为正常。所有受试者均签署知情同意书，试验方案经伦理委员会审批同意。

　　2.2 给药方案及血样采集

　　20名健康受试者分别单剂量口服愈酚甲麻那敏分散片(愈创木酚甘油醚100 mg)。于给药前和给药后的0.17、0.33、0.67、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、6.0、9.0 h， 前臂静脉采血约5 mL， 置肝素试管中， 3 500 r·min-1下离心10 min，分离血浆，血浆于-20 ℃冷冻保存。

　　2.3 血浆样品的测定

　　2.3.1 色谱条件

　　色谱柱：Agilent Eclipse XDB?C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm);流动相：乙腈?磷酸二氢铵(加浓磷酸，pH值3.0)=20∶80(体积比);流速:1.0 mL·min-1;检测波长：230 nm;进样量：70 μL，柱温：30 ℃。

　　2.3.2 血浆样品的处理 取血浆0.5 mL，置具塞玻璃试管中，补加水50 μL，加内标50 μL(4 μg·mL-1氧去甲右美沙芬)，加氨?氯化氨缓冲盐(pH=10)200 μL，涡旋2 s，加提取液[正己烷?二氯甲烷?异丙醇(体积比64∶33∶3)]提取20 min，3 500 r·min-1下离心10 min;吸取上清液，并于45 ℃水浴中氮气吹干，在残渣中加入磷酸溶液(0.05 mol·mL-1)200 μL，涡旋溶解30 s，取70 μL进样。记录色谱图。
　2.4 方法学考察

　　2.4.1 专属性 本色谱条件下，测得空白血浆、加对照品和内标的空白血浆、受试者口服愈酚甲麻那敏分散片后的血浆样品色谱图，见图1。由图1可见，愈创木酚甘油醚与内标的保留时间分别为4.894、3.908 min，血浆中内源性物质及甲麻黄碱、氯苯那敏不干扰愈创木酚甘油醚与内标的测定。

　　2.4.2 标准曲线制备 取空白血浆0.5 mL，置10 mL具塞试管中，依次加入50 μL质量浓度为250、500、10 00、20 00、4 000、10 000、20 000 ng·mL-1的愈创木酚甘油醚标准系列水溶液，配制相当于血浆药物质量浓度为25、50、100、200、400、1 000、2 000 ng·mL-1的血浆样品，加入内标溶液50 μL，按“2.3.2”项下操作，以血浆中愈创木酚甘油醚的质量浓度为横坐标，以愈创木酚甘油醚与内标的峰面积比为纵坐标，用加权最小二乘法进行回归计算，求得标准曲线方程为Y=0.00219X-0.01848(r=0.997 7);线性范围为25～2 000 ng·mL-1;最低定量质量浓度为25 ng·mL-1。

　　2.4.3 回收率及精密度试验 取空白血浆0.5 mL，按照“2.4.2”项下操作，分别配制高、中、低3种不同浓度的质量控制样品(50、200、1 000 ng·mL-1)，每个浓度水平进行6样本分析，结果血浆中愈创木酚甘油醚的提取回收率及日内、日间RSD见表1。表1 回收率及精密度试验结果

　　2.4.4 稳定性试验 取空白血浆0.5 mL按照“2.4.2”项下操作，分别配制高、中、低3种不同质量浓度的质量控制样品(50、200、1 000 ng·mL-1)，经反复3次-20 ℃冻融、预处理后室温放置24 h和-20 ℃冰箱中保存1个月后，测定样品浓度。结果显示，所有测定值和初始值的相对误差值(RSD%)均小于15%，表明样品稳定性良好。

　　2. 5 数据处理

　　根据血药浓度的数据，Cmax、tmax采用实测值;AUC0→4、t1/2等药动学参数采用DAS软件计算。

　　3 结 果

　　按上述方法测定受试者血浆样品，并以当日的标准曲线计算各时刻样品中愈创木酚甘油醚的浓度。20名健康志愿者单剂量口服愈酚甲麻那敏分散片后，平均血药浓度—时间曲线见图2。从图2可见，愈创木酚甘油醚口服吸收较快,tmax为(0.275±0.123)h，Cmax为(474±14)ng·mL-1， t1/2为(0.83±0.55)h，采用梯形法计算AUC0→4和AUC0→∞分别为(451±165)ng·h·mL-1和(505±159)ng·h·mL-1。

　　4 讨 论

　　4.1 血浆样品处理

　　经实验发现，如果不加缓冲液就直接加入提取溶剂进行提取，提取回收率不稳定，不利于测定。因此，分别尝试了KH2PO4?K2HPO4缓冲盐(pH=7.8)和10%氨水溶液，结果均出现乳化现象，加入pH值为10.0的氨?氯化氨缓冲盐时，能够得到较好的回收率。

　　曾采用乙醚?二氯甲烷、乙醚?叔丁基醚及正己烷?二氯甲烷?异丙醇[2] 3种提取溶剂，分别在紫外吸收波长278 nm和230 nm处进行测定。经比较发现，虽然用乙醚?二氯甲烷或乙醚?叔丁基醚提取，在两个波长下愈创木酚甘油醚均有较大的提取回收率，但提取出的干扰物质比较多，不利于测定。最终采用了正己烷?二氯甲烷?异丙醇做为提取溶液，并将最低定量下限降低至25 ng·mL-1。

　　4.2 分析方法学考察

　　曾考虑用甲醇?磷酸二氢铵做流动相，结果发现溶剂峰始终干扰测定，改用乙腈?磷酸二氢铵(体积比20∶80，浓磷酸调节pH值3.0)作为流动相，愈创木酚甘油醚和内标均不受干扰，检测物和内标在3.7～5.3 min内出峰，有较好的分离度和较短的保留时间。同时，愈酚甲麻那敏分散片中的其他成分——消旋盐酸甲麻黄碱和马来酸氯苯那敏也不干扰测定。该流动相柱压较低,有利于大样本、长时间的检测。

　　4.3 药动学研究

　　关于消旋盐酸甲麻黄碱、马来酸氯苯那敏和愈创木酚甘油醚复方制剂的体内药动学研究目前尚未见报道。据文献报道[1,2，5]，愈创木酚甘油醚单独给药在正常人体内的Cmax大于600 ng·mL-1，在本试验中，Cmax降低为474 ng·mL-1，同时AUC0→∞也小于文献报道的875.4 ng·h·mL-1。本复方制剂的3种主成分，甲麻黄碱对肾上腺素受体α、β均有激动作用，氯苯那敏有抗组胺作用，愈创木酚甘油醚可刺激胃黏膜的神经末梢，三者合用可能对愈创木酚甘油醚的体内代谢有影响，这还有待进一步研究。

　　实验表明，本方法简便、准确、可靠，能够满足愈创木酚甘油醚的临床药动学研究。

【参考文献】
  　　[1] 肇丽梅，张桂凤，段旭.复方甘氨酸茶碱钠的体内过程及相对生物利用度研究[J].临床药学，2002，37(10)：761.

　　[2] 杜玥，钟大放，肇丽梅，等.愈美分散片人体药动学及制剂生物等效性研究[J].沈阳药科大学学报，2001，18(3)：157.

　　[3] 刘欢，只德广，高晶，等.复方愈麻美芬缓释片在Beagle犬体内的药物动力学研究[J].沈阳药科大学学报，2004，21(5)：328.

　　[4] SHARAF M H，STIFF D D.Determination of guaifenesin in human serum by capillary gas chromatography and electron capture detection[J].J Pharm Biomed Anal，2004，35(7)：801.

　　[5] 廖琼峰，谢智勇，董迪，等. LC/MS/MS法测定人血浆中愈创木酚甘油醚浓度及药动学研究[J]. Chin Pharm，2007，18(14)：1068.