联苯双酯固体脂质纳米粒的体外释药特性评析

摘要】  目的 建立联苯双酯固体脂质纳米粒（DDB?SLN）体外释放的评价方法。方法 考察DDB?SLN在不同介质中的平衡溶解度，并筛选出pH 7.4磷酸盐缓冲液+40%(体积分数）乙醇作为合适的释药介质，采用动态透析释药法考察DDB?SLN和药物溶液的体外释药情况。结果 DDB?SLN在最初的0.5 h内出现了突释现象，此后DDB?SLN的释放符合一级动力学方程。结论 与药物溶液相比，DDB?SLN具有明显的缓释效果。

【关键词】  联苯双酯 固体脂质纳米粒 体外释药 动态透析释药法

联苯双酯(DDB)系合成五味子丙素的中间体，是20世纪80年代我国自行研制成功的抗肝炎药。由于其降转氨酶作用显著，同时还能促进肝脏再生，具有保肝、护肝的功能，该药在我国及其他多个亚洲国家广泛应用于乙肝及丙肝的治疗［1］。本文采用乳化蒸发-低温固化法［2］制备了联苯双酯固体脂质纳米粒（DDB?SLN），然后用动态透析法考察其体外释药情况，为体内研究提供了依据。

　　1    仪器及试剂

　　1.1    仪器    戴安P680分析型高效液相色谱仪(美国)；HJ?3恒温磁力搅拌器（江苏金坛医疗器械厂）；UV?2800紫外可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司）；AG245型电子天平（德国 Mettler Toledo公司）。

　　1.2    试剂    联苯双酯（浙江万邦药业有限公司，批号：070301）；联苯双酯对照品（中国药品生物制品检定所，批号：0192?950150）；DDB?SLN（自制）；甲醇（色谱纯）；透析袋(截留分子量：8 000～14 000)；其他试剂均为分析纯。

　　2    实验方法

　　2.1    DDB?SLN的制备［3］
      　　
　　称取DDB 5 mg、单硬脂酸甘油酯50 mg、卵磷脂80 mg溶于适量的无水乙醇中，于（75±2）℃水浴下形成有机相；另取泊洛沙姆188 150 mg溶于相同温度的水中，构成水相；在搅拌（1 000 r/min）下将有机相用针头注入水相中，整个过程保持温度在脂质材料熔点以上。搅拌2 h，浓缩体积至原来的1/2。将所得的半透明体系快速分散于0～2 ℃水相中，继
续搅拌1 h，即得固体脂质纳米粒混悬液。

　　2.2    分析方法的建立

　　2.2.1    色谱条件    DDB的色谱条件参见文献［3］。

　　2.2.2    标准曲线的绘制    精密称取DDB对照品10 mg，置50 mL的容量瓶中，用2 mL乙腈溶解，再加释药介质［pH 7.4磷酸盐缓冲液(pH 7.4 PBS)+40%乙醇］定容至刻度，作为储备液。分别吸取上述储备液0.  125、0.25、0.5、0.15、4、7、10 mL置100 mL的容量瓶中，释药介质定容至刻度，使其质量浓度为0.  25、0.5、1、3、8、14、20 μg·mL-1。以峰面积(A)对质量浓度(ρ)进行线性回归，得回归方程
A=0.  7088ρ+0.0535，r=0.999 9。

　　2.3    体外透析释药法［4］

　　2.3.1    释药介质的筛选    采用饱和溶液法测定了DDB在几种不同介质中的平衡溶解度。将过量的DDB原料药分别加至装有pH 7.4 PBS+40%乙醇、40% PEG400水溶液+0.5%吐温80溶液、0.45%十二烷基硫酸钠溶液（SDS）、生理盐水、蒸馏水的10 mL具塞试管中，使均达到过饱和状态，然后放入恒温37 ℃水浴中，振摇，定时取样经0.  45 μm微孔滤膜滤过后，取续滤液以紫外可见分光光度法测定吸光度，至连续3次测得的吸光度基本恒定时停止取样。将各自的吸光度代入各自标准曲线，计算浓度，即为DDB在各种不同介质中的平衡溶解度。结果见表1。

　　表1    联苯双酯在不同介质中的平衡溶解度（略）

　　Table 1    Solubility of bifendate in different media

　　由表1可知，DDB在pH 7.4 PBS+40%乙醇中的溶解度最大，并能满足体外释药的要求，所以选择pH 7.4 PBS+乙醇的体系作为释药介质。

　　2.3.2    DDB在不同比例的PBS/乙醇体系中溶解度的考察    将过量的DDB原料药分别加至装有pH 7.4 PBS+5%乙醇、pH 7.4 PBS+10%乙醇、pH 7.4 PBS+20%乙醇、pH 7.4 PBS+40%乙醇的10 mL具塞试管中，均达到过饱和状态。但是当乙醇含量过高时，会导致体外释药和体内释药的不吻合。将它们放入恒温37 ℃水浴中，振摇，定时取样经0.45 μm微孔滤膜滤过后，取续滤液以紫外可见分光光度法测定吸光度，至连续3次测得的吸光度基本恒定时停止取样。将各自的吸光度代入各自标准曲线，计算浓度，即为DDB在各种不同介质中的平衡溶解度。结果见表2。

　　表2    联苯双酯在不同比例的PBS+乙醇体系中的溶解度（略）

　　Table 2    Solubility of bifendate in media compromised of PBS and CH3CH2OH at different ratio

　　由表2可知，DDB在pH 7.4 PBS+40%乙醇中的溶解度最大，药物的溶出更好，所以选择pH 7.  4 PBS+40%乙醇的体系作为释药介质。

　　2.3.3    DDB在释放介质中的稳定性考察    采用高效液相色谱法测定纳米粒的释药情况，考察DDB在释放介质中的稳定性。用释药介质（pH 7.4 PBS+40%乙醇）配制含DDB(20 μg/mL)的样品液，测定其在0～48 h间的峰面积变化，其RSD为1.  37%(n=3)，表明DDB在该释药介质中的稳定性满足要求。

　　2.3.4    纳米粒的释放曲线    将一定体积的DDB?SLN混悬液(药物量约为1 mg)，置于分子截留量为8 000～14 000的透析袋中，用透析夹夹紧，放入250 mL的释药介质(pH 7.4 PBS+40%乙醇溶液)中，以100 r·min-1的速度搅拌，于（37±0.5）℃动态透析，平行操作3份。分别于释放开始后的10、30 min以及1、2、4、6、8、10、12、24 h精密吸取2.  0 mL的释放液，同时补加缓冲液。将所取样液经0.  45  μm的微孔滤膜过滤后,采用HPLC测定释放介质中联苯双酯的浓度，计算累计释放量。结果见图1。
　图1    联苯双酯溶液及固体脂质纳米粒的体外释放曲线（略）

　　Figure 1    Average curve of accumulated release of bifendate from bifendate?solid lipid nanoparticles and bifendate solution in media

　　2.3.5    释药机理的研究    目前解释缓控释制剂的释药动力学方程主要是在Fick?s扩散定律［5］的基础上，进行了相关的假设后，给出的近似解释。通过实验先求出各时间点的累积释放量，采用5种常见的释药模型对DDB?SLN的体外释放进行拟和。观察相关系数，选择最佳拟合方程。结果见表3。
     
　　由表3可知，拟合结果较好的是一级释药、Weibull方程、Higuchi方程。其中以一级释药方程拟合最佳，释放初期有药物突释现象的产生，随后药物呈现持续而缓慢的释放。

　　表3    联苯双酯固体脂质纳米粒体外释药的拟合结果（略）

　　Table 3    Regressing results for dissolution of bifendate?solid lipid nanoparticles

　　3    讨论
      　　
　　由图可知DDB?SLN在释放介质中完全释放约需24 h；而在DDB溶液中，大部分药物在约8 h时都已扩散出来，说明透析袋对DDB的扩散阻碍作用较小，满足透析法释药的条件。由所测得的释药曲线可以观察到初期的药物突释现象，随后SLN中的药物呈持续缓慢释放,体外释药符合一级动力学方程。由释放结果可知，在最初的0.5 h，释放了药物总量的5.86%，小于药典规定的40%的上限。这部分释放的药物，主要来自于没有包裹到脂质材料中的游离药物和吸附于脂质纳米粒表面的药物。
     
　　制剂体外释药动力学的研究，常用的方法有透析袋法、超速离心法、超滤、生物膜扩散技术等，其中透析袋扩散技术是较常用的方法。但有文献报道［6］，由于纳米粒在透析袋中未被释药介质充分稀释，没有满足漏槽条件，得到的结果往往于释药速度无关，仅与药物在纳米粒与透析液的分配行为有关。在本实验中，由于DDB?SLN载药量较低，250 mL的释药介质即可使DDB?SLN胶体溶液满足漏槽条件。
      　　
　　本文采用经典的动态透析技术测定DDB?SLN的体外释药情况,进行了有关方法学考察，包括释药介质的筛选、药物在介质中的稳定性考察、药物溶液在透析袋内的透析情况及药物含量的测定等，均满足有关实验要求。由本文结果可知，与DDB药物溶液相比，DDB?SLN混悬液具有一定的缓释效果。

【参考文献】
  　　［1］ 王彩福，张育轩，于惠钦，等．联苯双酯治疗病毒性肝炎382例临床疗效观察［J］．天津医药，1982，10(2)：93-96.

　　［2］ 陈大兵，吕万良，杨天智,等．紫杉醇长循环固态脂质纳米粒的制备和体内外的研究［J］．药学学报，2002，37(1)：54-58.

　　［3］ 张洪，詹新安，成蓓，等.联苯双酯固体脂质纳米粒的制备［J］.广东药学院学报，2008，24（1）：37-40.

　　［4］ 符旭东，高永良，平其能．石杉碱甲缓释微球的体外释放度及其体内外相关性研究［J］．医药导报，2005，24(11)：994-996.

　　［5］ 卢元东,王登明．膜控释药的机理及影响因素［J］．国外医药：合成药、生化药、制剂分册,1992，13(5)：296-299.

　　［6］ WASHINGTON C. Evaluation of non?sink dialysis methods for the measurement of drug release from colloids:effect of drug partition［J］．Int J Pharm, 1989，56：71-74.