体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞向肺泡上皮细胞的分化

骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一种具有多分化潜能的干细胞，在不同的培养条件下可分化为一系列的细胞类型。肺损伤体内实验研究表明，肺损伤小鼠移植MSCs后，MSCs可转化为肺泡Ⅱ型(type Ⅱ alveolar epithelial cell, AECⅡ)和Ⅰ型上皮细胞(type Ⅰ alveolar epithelial cell, AECI)等，以修复损伤肺组织[1]。ROJAS等[2]研究发现，在体外损伤肺组织分泌的因子可以诱导MSCs增殖并向损伤肺迁移，而正常肺组织细胞并没有此功能。POPOV等[3]采用MSCs与肺上皮细胞(A549)非接触共同培养，成功诱导MSCs向肺上皮细胞分化。本研究采用MSCs与肺组织单细胞悬液非接触共培养模型，观察能否在体外利用损伤肺组织诱导MSCs向肺泡上皮细胞分化,为进一步研究骨髓源性的间充质干细胞治疗肺损伤奠定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　出生4周的健康昆明小鼠，体重为10.0～11.5g，共25只，均为雄性(中国医学科学院实验动物中心提供)。DMEM完全培养基和标准胎牛血清(GIBCO公司，美国)，胰蛋白酶(Sigma公司，美国)。Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司，日本)，RT-PCR试剂盒(QIAGEN，德国)。 倒置显微镜(TE2000, Nikon公司，日本)，高分辨率成像系统(DXM1200C，尼康，日本)，激光共聚焦显微镜(C1-SHS，尼康公司，日本)，二氧化碳细胞培养箱(SKP-02B，湖北省黄石市恒丰医疗公司)，24孔板(Hanging Cell Culture Insert PET 0.4μm，MILLPORE公司，德国)。

　　1.2  小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的体外分离、扩增和鉴定

　　小鼠颈椎脱臼处死后，放入750mL/L的酒精内浸泡5min。无菌条件下取出双侧股骨，去除附带组织，两端剪断暴露骨髓腔。用含100mL/L胎牛血清的DMEM培养液及1号针头反复冲洗，将骨髓腔内的骨髓冲出，并用1号针头反复抽吸，制成单细胞悬液，充分混匀，转入离心管，1500r/min离心5min弃上清及脂肪层，沉淀用DMEM培养液充分混匀，用吸管轻轻叠加到密度为1.077g/mL的Ficoll-Paque分离液上，2500r/min离心10min，取界面层的单核细胞，再用DMEM培养液多次洗涤，离心后备用。细胞沉淀以5×105个/cm2密度接种于培养瓶，加入DMEM完全培养液置于37℃，50mL/L CO2，80%相对湿度的培养箱中，2d后全量换液，去除未贴壁的细胞，以后每隔3d换液1次，倒置相差显微镜逐日观察细胞的形态，贴壁情况及生长情况。待细胞融合达80%，胰酶37℃消化，进行传代、扩增培养。取培养第2代的细胞用PBS洗涤3次，胰酶消化成单细胞悬液，将细胞悬液移入离心管，1500r/min离心5min，弃上清，细胞沉淀PBS洗涤3次，分别加入荧光标记的抗体，4℃孵育30min，PBS洗去未标记抗体，10g/L多聚甲醛固定，应用FACScan流式细胞仪检测细胞表面抗原表达。

　　1.3  建立体外非接触共培养实验模型

　　参照本实验室的方法建立小鼠肺损伤模型[4]，并参照POPOV等[3]方法建立体外非接触共培养实验模型，实验模型图见图1。无菌条件下分离提取无肺损伤肺组织(共25只小鼠)、肺损伤模型肺组织(共25只小鼠)。制备肺组织单细胞悬液。将约5×104个/mL的小鼠肺细胞接种于0.4μm孔径(Millpore)大小的膜上(悬挂式体外共培养小室)，并放入24孔板中，在24孔板的底部同时放上适当大小的载玻片，并接种约5×104个/mL小鼠骨髓来源间充质干细胞(MSCs)。共设计三组，每组6孔：对照组：MSCs单独静置培养；实验组A： 正常健康肺组织单细胞悬液(上室)+MSCs(下室)；实验组B：损伤组肺组织单细胞悬液(上室)+MSCs(下室)细胞。共同培养8d，每日倒置相差显微镜下观察细胞形态，贴壁情况及生长情况。
　
　　1.4  激光共聚焦显微镜检测表面蛋白C(surfatcant protein C, SP-)和水通道蛋白5(aquaporin protein 5, AQP-5)的荧光表达

　　在共培养的第8天，根据以下步骤处理细胞标本：①将共培养中接种有MSCs的载玻片取出，40g/L的多聚甲醛固定10min，0.01mol/L PBS漂洗3～5次；②在同一培养皿中分别加入PBS稀释抗-SP-C(1∶100)一抗和抗-AQP5(1∶100)，湿盒内4℃孵育24h，0.01mol/L PBS漂洗3次；③加入FITC标记和TRITC标记的抗兔IgG(1∶100)，37℃孵育2h，0.01mol/L PBS漂洗3次；④0.01mol/L PBS充分洗涤后加入终浓度为10mg/L Hoechst 33342约1mL，室温孵育20min；以抗体稀释液代替单克隆抗体作为阴性对照试验。⑤0.01mol/L PBS充分洗涤后用VECTASHIELD? Mounting Medium封片，采用激光共聚焦显微镜观察SP-C、AQP5的荧光表达情况。

　　1.5  RT-PCR 检测非接触共培养体系模型下室中的SP-C和AQP5 mRNA

　　1.5.1  总RNA的提取

　　RNA抽提试剂盒为Qiagen公司产品，具体操作按照试剂盒说明书。

　　1.5.2  cDNA第一链合成反应

　　20μL反应体积中含2μL 10×PCR buffer、2μL 2mmol/L dNTP、4μL 25mmol/L MgCl2、0.5μL RNase抑制剂、2μL RNA模板、1μL oligo dT引物、7.5μL无RNase水，反应条件为：50℃ 30min，99℃ 5min，5℃ 5min。

　　1.5.3  PCR扩增反应

　　通过对AQP-5和SPC基因组DNA序列分析，用计算机辅助生物软件Primer 5.0(Applied Biosystem, Inc.Co.)设计了两对引物，AQP-5:Forward(5′-3′)：TGTCGTCGTGGTGATTGTA；Reverse(5′-3′)：ACTGTGCCCTTCTTCCTG。预计扩增片段长为355bp；SPC：Forward(5′-3′)：GAGCCAGTTTCGCATTCC；Reverse(5′-3′)：CAGGTCTCGCCCAGAAGA。预计扩增片段长为463bp。引物由上海生工合成。PCR反应体系包括：每种dNTP 250μmol/L，MgCl2 2.5μmol/L，10×PCR缓冲液5μL，Taq酶5u，反转录产物3μL，引物0.1μmol/L/条，终反应体系50μL。PCR反应在PX-2型PCR仪上进行，AQP-5循环条件为：95℃ 10min；94℃ 60s，48℃ 90s，72℃ 60s，35个循环；72℃ 10min。SPC循环条件为：95℃ 10min；94℃ 60s，50℃ 90s，72℃ 60s，35个循环，72℃ 10min。取5μL产物经12g/L琼脂糖电泳，鉴定产物的特异性。最后将所获得的PCR产物利用GeneTools(SynGene公司，版本：3.07)进行产物量的测定(丰度图结果未显示)。

　　1.6  统计学处理

　　所有数据以均数±标准差(±s)表示，采用SPSS13.0统计软件包对数据进行统计分析，实验结果均数之间比较采用General Lineral Model(GLM)模型进行析因多因素方差分析，P<0.05为具有统计学意义。
　2  结 果

　　2.1  小鼠骨髓间充质干细胞的体外分离、纯化、扩增和鉴定

　　骨髓单核细胞悬液接种于塑料培养瓶后，细胞在培养瓶底散在分布，呈圆形，48h后完全换液，去除未贴壁的血细胞。此时贴壁的细胞为单个或几个细胞的克隆，细胞形态均一，为长梭形。培养至10～12d，细胞接近融合，每个克隆约数百至数千个细胞，集落之间细胞出现重叠，细胞形态均一，随着培养时间的延长，旋涡中心的细胞可形成多细胞层，细胞界限不清，黏附于贴壁细胞之上的杂细胞在换液的过程中逐渐被清除。传代后的MSCs增殖生长仍然迅速，生长潜伏期较短，7～10d即达到完全融合(图2)。流式细胞仪结果显示二代细胞均一性在95%以上，CD34、CD45表达为阴性，证明这一类细胞为非造血类细胞。CD105、CD106表达阳性(图3)。
　
　　2.2  激光共聚焦显微镜检测SP-C和AQP5的荧光表达

　　于共培养的第8天处理标本，然后用激光共聚焦观察各处理组共培养下室中的免疫荧光表达情况。对照组只检测到MSCs的蓝色荧光和AQP5的红色荧光(图4A)。实验组A也只检测到MSCs的蓝色荧光和AQP5的红色荧光(图4B)。实验组B可同时检测到MSCs的蓝色荧光，AQP5的红色荧光，以及绿色的SP-C的荧光(图4C、图4D)。

　　2.3  共培养体系下室中的SP-C和AQP5 mRNA的表达情况

　　2.3.1  对照组SP-C和AQP5 mRNA的表达情况

　　对照组于第1、5、8天检测AQP5和SP-C mRNA的表达情况。在共培养开始第1天，可检测到AQP5的mRNA表达，但AQP5的表达比较弱，不同时间段差异不明显，而在不同时间段SP-C都没有表达(图5)。

　　2.3.2  实验组A SP-C和AQP5 mRNA的表达情况

　　实验组A所检测到的SP-C和AQP5 mRNA的表达情况与对照组观察结果相似(图6)。

　　2.3.3  实验组B不同时间段SP-C和AQP5 mRNA的表达情况

　　实验组B在共培养的各时间段可同时检测到AQP5和SP-C mRNA的表达(图7，图8)。

　　2.3.4  不同实验处理组中AQP5和SP-C mRNA的表达量的比较 医学核心论文发表

　　对照组和实验组A各时间点均未见SP-C mRNA的表达，而在实验组B于共培养的第1、5、8天的SP-C mRNA的表达量分别为1599.00±158.95、2066.80±101.30、3893.00±178.60。不同处理组的AQP5 mRNA的表达量见表1。实验组B各时间点AQP5 mRNA的表达量与对照组比较，AQP5 mRNA的表达量明显增多(F=78.61，P<0.01)，而与实验组A的AQP5 mRNA的表达量比较，也有统计学差异(F=67.38，P<0.01)。但是，实验组A各时间点则与对照组比较无明显统计学差异(F=1.45，P>0.05)。表1  不同处理组AQP5mRNA的表达量的比较（略）
　
　　3  讨 论

    AECⅡ具有分泌肺泡表面活性物质、调节肺泡表面张力、维持肺液体平衡和多种防御功能，不仅可以修复肺泡的正常结构，更可以有效地恢复功能，从而阻止和修复肺损伤[5]。因此，体外或者体内诱导干细胞分化为AECⅡ一直是肺损伤修复的一个研究热点。研究表明，SP-C是AECII细胞表达的特征性蛋白，AECⅡ细胞可能是AECI的祖细胞，当AECⅡ可以转化为AECI后，获得AECI的表型特征AQP5，同时失去AECⅡ的表型标志SP-C[6]。因此，本实验选用SP-C和AQP5两个特异性蛋白来鉴定干细胞诱导分化为肺泡上皮细胞的效果。

    本实验建立的悬挂式体外非接触共培养小室，当MSCs单独静置培养时，或者与正常肺组织单细胞悬液共同培养时，在共培养的全部时段，都未检测到AECⅡ表达的特征性蛋白SP-C的表达，说明干细胞都没有转换为AECⅡ或者转化为AECⅡ细胞的数量非常少。该两种情况下都有AQP5的表达。而且，AQP5的表达量也没有变化。KOTTON[7]及其同事的研究发现体外培养的MSCs可表达AECI的特异性标记物AQP5，这种细胞亚型可能是肌细胞、骨细胞和脂肪细胞的多潜能干细胞。推测所检测到的AQP5表达是MSCs自身表达的结果，MSCs没有向AECI分化。而损伤肺组织与MSCs共培养时，不但有SP-C的表达，而且随着时间的延长，表达量逐渐增加，说明MSCs成功转换为AECⅡ；同时，AQP5表达量明显高于实验组A和对照组。我们推断AQP5表达量增加部分是由AECⅡ细胞转化为AECI细胞引起的或是MSCs直接分化为AECI。这与文献报道的用博来霉素导致小鼠肺损伤时，静脉注射外源性的MSCs，在受体小鼠肺中，比骨髓间充质干细胞移植前，MSCs总的DNA的含量升高23倍，同时AECⅡ的含量升高3倍的研究结果一致[8]。

    骨髓间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同的环境、不同的培养液中可以分化为多种细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝细胞、神经元样细胞、表皮细胞、血管内皮细胞等[9]。一种理论认为组织及器官损伤可以被干细胞感知，迁移到损伤部位并分化为器官特异的细胞，以修复损伤器官的结构和功能[10]。本研究通过非接触共培养，采用聚碳酸脂膜将损伤肺组织与干细胞分开，使损伤肺组织细胞不能通过，而细胞分泌的细胞因子可以自由通过，成功建立了体外非接触共培养诱导骨髓间充质干细胞分化为肺泡上皮细胞的模型，验证了该理论的正确性。研究报道，之所以损伤细胞能够诱导MSCs分化为损伤特异性的细胞，可能是因为损伤细胞分泌的特殊的细胞因子刺激MSCs或者是损伤细胞激活某个信号传导[2]。本研究中MSCs分化为肺泡上皮细胞的具体机制需要进一步的研究。医学核心论文发表

    采用骨髓间充质干细胞在细胞替代治疗、基因治疗以及组织器官的再造中具有重要的临床应用价值。骨髓采集方便、安全、损伤小，供者无明显并发症，有利于体外扩增和自体回植。本研究成功建立了体外诱导MSCs分化为肺泡上皮细胞的模型，有望为临床建立永不枯竭的肺细胞和组织来源，以修复和取代受损伤的肺组织和细胞，为根本性治疗肺损伤提供实验基础。