雌二醇鼻腔喷雾剂大鼠体内的药动学研究

【摘要】  目的 对雌二醇鼻腔喷雾剂大鼠体内药动学进行研究。方法 对大鼠鼻腔给予雌二醇?随机甲基化β?环糊精包合物的生理盐水溶液、雌二醇乙醇溶液和3种剂量的雌二醇鼻腔喷雾剂，用非隔室模型统计矩法进行了药物动力学研究，并与静脉注射雌二醇相比较计算绝对生物利用度。结果 雌二醇鼻腔喷雾剂三剂量给药组，雌二醇包合物生理盐水溶液和雌二醇乙醇溶液剂给药组的Tmax分别为30、25、13、20和5 min，Cmax分别为72.41、74.72、259.21、20.51和60.65 ng·mL-1，MRT分别为69. 60、146.52、740. 65、130.55和16.68 min。3个剂量组的雌二醇鼻腔喷雾剂的绝对生物利用度分别为86.87％、65. 83％和48. 99％，雌二醇包合物溶液组和雌二醇乙醇溶液剂组的绝对生物利用度分别为56.44％和24. 38％。结论 雌二醇鼻腔喷雾剂0. 16和0.48 mg·kg-1剂量组的绝对生物利用度均高于单独鼻腔给予雌二醇环糊精包合物溶液和雌二醇乙醇溶液组。

【关键词】  雌二醇 鼻腔喷雾剂 随机甲基化β 环糊精 药动学

雌二醇（Estradiol, E2）是内源性最强的雌激素，临床上用于改善更年期症状，预防骨质疏松症，防治妇女卵巢切除和原发性卵巢功能障碍等。目前E2的补充疗法最常用的方法是口服、经皮及阴道补充疗法，但是这些方法在使用中都有一定的局限性。口服给药存在肝肠的首过效应,所以生物利用度比较低［1,2］，经皮给药的病人中10％～30％会有皮肤刺激的现象［3］，阴道用制剂具有子宫放大反应，且患者适应性差［4］。近年来，鼻腔给药系统因其生物利用度高，使用方便，给药剂量下毒副作用小等特点被广泛应用作为药物的给药形式，尤其是雌激素类药物的鼻腔给药方式还能够防治绝经期所带来的后遗症（骨质疏松症），从而提高病人的依从性，更易被患者接受。本文的目的是研究自制雌二醇鼻腔喷雾剂的大鼠体内药动学，并与雌二醇乙醇溶液和雌二醇包合物溶液进行对比。

　　1    仪器与试药 

　　1．1    仪器
     
　　日立L?7200高效液相色谱仪（日本）；日立L?7485型荧光检测器（日本）；81?2型恒温磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）。

　　1．2    试药
     
　　雌二醇 （浙江医药股份有限公司仙居制药厂）；乌拉坦（中国医药上海化学试剂公司）；随机甲基化?β?环糊精（randomly methylatedβ?cyclodextrin,RAMEB, 德国瓦克公司）；壳聚糖（大连鑫蝶甲壳素有限公司）；对羟基苯甲酸乙酯（沈阳市东兴试剂厂）；苯扎氯铵（Sigma公司）；甲醇（色谱纯，天津康科德试剂公司）；其他试剂均为分析纯。

　　1．3    动物
     
　　Wistar 雄性大鼠(体质量220～250 g)，广东省医学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（粤）2003?002。

　　2    方法

　　2．1    样品的配制

　　2．1．1    E2鼻腔喷雾剂的制备    E2与RAMEB以1∶1的摩尔比制备包合物，壳聚糖的用量为1％，苯扎氯铵的用量为0.01％，氯化钠调节等渗，pH值在4.  0～6.0之间。

　　2．1．2    E2?RAMEB包合物溶液的制备    称取适量的E2?RAMEB包合物溶解于生理盐水中，氯化钠调节等渗，即得。

　　2．1．3    E270％乙醇溶液的制备    称取E2原料药适量，将其溶于70％乙醇中即得。

　　2．1．4    E2注射剂的制备    称取适量的E2，将其溶解于注射用水配制的0.01％（质量浓度）RAMEB溶液中，即得。

　　2．2    给药剂量的确定
      　　
　　按体表散热量折算，250 g 大鼠的剂量为60 kg人用剂量的0.025倍，再根据鼻腔给药和静脉注射给药的差异性及在测定过程中的准确性，确定雌二醇鼻腔喷雾剂的给药剂量分别为0.16、0.48和1.  60 mg·kg-1，E2?RAMEB包合物生理盐水溶液、雌二醇乙醇溶液剂和静脉注射给药的剂量均为0.  16 mg·kg-1。

　　2．3    给药方法及血浆样品的采集

　　2．3．1    鼻腔给药方法及血浆样品的采集         取雄性SD大鼠，体质量200～250 g，腹腔注射1.2 g·kg-1的乌拉坦使大鼠麻醉，固定，打开颈部，暴露气管与食管，取一段聚乙烯管插入气管以维持呼吸。再在颈总静脉上插管供取血用。用微量注射器前接一柔软PE管插入大鼠鼻孔约5 mm，缓慢滴入药液。给药后立即结扎食管以防药液从鼻腔流失。给药后取血时间点为5、10、20、30、45、60、90、120、150、180 min，每次取血0.4 mL，8 000 r·min-1离心15 min，取出上层血浆，－20  ℃冷冻保存。

　　2．3．2    静脉给药方法及血浆样品的采集         大鼠麻醉，剪开一侧腹股沟皮肤，暴露浅表股静脉，分离覆盖黏膜层，左手食指按住股静脉近心端，待股静脉充盈后，1 mL注射器配4号针头，以30°角进行静脉穿刺，推注药液无阻力感，表明针头在血管中，继续缓慢推完药液，给药完毕后用干棉球压迫止血。眼眶取血。给药后取血时间点为5、10、20、30、45、60、90 min，每次取血0.4 mL，8 000 r·min-1离心15 min，取出上层血浆，－20 ℃冷冻保存。

　　2．4    RP?HPLC荧光法测定血浆中E2的浓度［5，6］

　　2．4．1    色谱条件    　　色谱柱为Kromasil ODS C18色谱柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm, Zirchrom）；流动相为乙腈?水（体积比40∶60），流速为1 mL·min-1；荧光的激发波长为267 nm，发射波长为302 nm；检测温度为30 ℃。

　　2．4．2    内标溶液的配制        精密称取对羟基苯甲酸乙酯50 mg，置50 μL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得内标储备液。用甲醇稀释为12.5 μg·mL-1的内标溶液。

　　2．5    血浆样品处理和测定方法
      　　
　　取全血约0.5  mL，于8 000 r·min-1离心10 min，精密量取血浆0.2 μL，置刻度具塞试管中，用微量进样器加内标溶液5 μL，旋涡振荡2 min，再加入5 mL乙醚，旋涡振荡5 min，于3 000 r·min-1离心5 min，吸取上层乙醚，40 ℃用氮气吹干，然后加入200 μL甲醇溶解，每次进样50 μL。以E2和内标峰面积比R＝As／Ai（As为E2峰面积，Ai为内标峰面积）为定量依据，计算样品中E2的含量。

　　2．6    样品稳定性试验 
      　　
　　取大鼠空白血浆200 μL，配制E2低、中、高3个浓度 （浓度分别1.984、99.200和496.000 ng·mL-1）的血浆样品，样品经液?液提取处理后，室温（约20 ℃）下放置24 h测定，以考察处理后的E2血浆样品在室温下的稳定性。每一浓度进行3样本分析。3个浓度下血浆样品中E2测定均值与加入值之间的相对误差（RE/%）分别为3.1%，2.1%和5.  3%，表明血浆样品处理后在室温下至少可稳定存放24 h。
          
　　同法配制低、中、高3个浓度（浓度分别1.984、99.200和496.000 ng·mL-1）的血浆样品，经反复3次-20 ℃冷冻，室温溶解后，测定样品浓度，以考察样品在冷冻和冻融条件下的稳定性。每一浓度进行3样本分析。3个浓度下血浆样品中E2测定均值与加入值之间的相对误差（RE/%）分别-1.9%，-3.3%和1.6%，表明血浆样品在冷冻?融溶循环3次试验中无明显降解。

　　2．7    大鼠体内药物浓度?时间曲线
      　　
　　大鼠鼻腔及静脉注射给予E2后的平均血药浓度对时间做图得药物浓度?时间曲线；利用统计矩法对血浆药物浓度数据进行分析（Cmax和Tmax采用实测值）。

　　2．8    绝对生物利用度
         
　　将各鼻腔给药组的血药浓度?时间曲线下面积与静脉注射给药组的曲线下面积相比较，按下列公式得各鼻腔给药组E2的绝对生物利用度（F）。

　　F=AUC0→∞(i.n)/Xi.n.AUC0→∞(i.v.)/Xi.v.×100%

3    结果

　　3．1    大鼠体内药物浓度?时间曲线
      　　
　　各样品大鼠鼻腔及静脉注射给予E2后的平均血药浓度?时间曲线见图1-4。

　　3．2    绝对生物利用度
      　　
　　计算各鼻腔给药组E2绝对生物利用度，结果见表1。

　　图1    雌二醇鼻腔喷雾剂鼻腔给药后大鼠体内血药浓度?时间关系曲线图（略）

　　Figure 1    Plasma concentration?time curves in rats nasally administered with estradiol nasal spray at the doses of 0.  16, 0.48, and 1.60 mg·kg-1

　　图2    雌二醇环糊精包合物溶液鼻腔给药后大鼠体内血药浓度?时间关系曲线图（给药剂量：0.16 mg·kg-1）（略）

　　Figure 2    Plasma concentration?time curves in rats nasally administered with estradiol?RAMEB solution at the dose of 0.16 mg·kg-1

　　图3    雌二醇乙醇溶液鼻腔给药后大鼠体内血药浓度?时间关系曲线图（给药剂量：0.16 mg·kg-1）（略）

　　Figure 3     Plasma concentration?time curves in rats nasally administered with estradiol?ethanol solution at the dose of 0.16 mg·kg-1  

　　图4    静脉注射雌二醇溶液后大鼠体内血药浓度?时间关系曲线图（给药剂量：0.  16 mg·kg-1）（略）
   
　　Figure 4    Plasma concentration?time curves in rats intra?venously injected with estradiol?ethanol solution at the dose of 0.16 mg·kg-1

　　表1    鼻腔给药后各制剂的主要药动学参数（略）

　　Table 1    Pharmacokinetic parameters after nasal administered with different preparations of estradiol

　　由于E2鼻腔喷雾剂的体内过程复杂，药时曲线无法按现有的数学模型进行处理，因此，采用梯形法计算AUC，并经统计矩处理计算MRT等药动学参数。检验结果显示，E2鼻腔喷雾剂0.16 mg·kg-1剂量组的Cmax与E2鼻腔喷雾剂1.60 mg·kg-1剂量组和E2?RAMEB包合物溶液组之间差异有显著性，AUC与E2鼻腔喷雾剂0.48、1.60 mg·kg-1剂量组和E2乙醇溶液剂组间差异有显著性（P<0.05）。经计算3个剂量组的E2鼻腔喷雾剂的绝对生物利用度分别为86.87％、65.83％和48.99％， E2?RAMEB包合物溶液组和E2乙醇溶液剂组的绝对生物利用度分别为56.44％和24.38％。E2鼻腔喷雾剂0.16和0.48 mg·kg-1剂量组的绝对生物利用度均高于单独鼻腔给予E2?RAMEB包合物溶液，从而说明鼻腔给予E2鼻腔喷雾剂提高了E2鼻腔吸收的生物利用度。

　　4    讨论

　　4．1    动物模型的选择
      　　
　　选择合适的动物模型对于确定鼻腔给药后药物的有效性非常重要。大鼠等哺乳动物的嗅细胞散在分布于整个鼻腔中，与人体嗅黏膜分布于鼻腔顶部不同，并且嗅细胞数量多，嗅黏膜占鼻黏膜总表面积的比例也高于人体，所以大鼠鼻腔给药后的实验结果只能作为人体的一种参考。虽然不能直接将大鼠的研究数据推之于人，但可认为其转运趋势是一致的。

　　4．2    研究方法的建立
      　　
　　大鼠鼻腔给药的研究方法是Harai等于1981年建立的［7］。为了将药物完全保留在鼻腔中，Harai等采用胶黏剂聚α?氰基丙烯酸酯封堵鼻腭通道，减少药物向口腔的清除。由于胶黏剂封堵鼻腭通道时易渗入大鼠鼻腔，瞬间黏合形成胶状膜，影响药物的鼻黏膜吸收，且对动物的损伤大，故本研究采用给药后立即结扎食管来代替胶黏剂封堵，操作简便且可有效防止药液吞咽。

　　4．3    吸收结果的讨论
         
　　雌二醇的乙醇溶液鼻腔给药并没有观察到吸收相，其可能的原因是乙醇作为一种渗透促进剂能够显著的提高药物对于鼻腔黏膜的通透性，增加药物对于黏膜的透过速率；其次，鼻腔纤毛的摆动运动也会将一部分的药物清除；即在测定时间点前，药物已经达到了吸收的峰值，因此在第一个时间点开始并未观察到药物的吸收相。

【参考文献】
  　　［1］ GENAZZANI A R, GAMBACCIANI M. HRT in the third millennium［J］.Maturitas,2001,38(1): 49-55.

　　［2］ O′CONNELL M B. Pharmacokinetic and pharmacologic variation between different estrogen products ［J］.J Clin Pharmacol,1995,35:18-24.

　　［3］ FRASER D I，PARSON A, WHITEHEAD M I,et al. The optimal dose of oral norethindrone acetate for addition to transdermal estradiol：a multicenter study［J］.Fertil Steril,1990,53:460-468.

　　［4］ 郑彩虹，梁文权.阴道内给药系统发展现状［J］.中国现代应用化学杂志，2002,19(6):465-469.

　　［5］ YOON Y, WESTERHOFF P, SNYDER S A,et al. HPLC?fluorescence detection and adsorption of bisphenol A, 17β?estradiol, and 17α?ethynyl estradiol on powdered activated carbon［J］. Water Res,2003,37(14):3530-3537.

　　［6］ ALKHARFY K M, FRYE R F. Sensitive liquid chromato?graphic method using fluorescence detection for the determination of estradiol 3?and 17?glucuronides in rat and human liver microsomal incubations: formation kinetics［J］.J Chrom B,2002,774:33-38.

　　［7］ HIRAI S, YASHIKI T, MIMA H. Effect of surfactants on the nasal absorption of insulin in rats ［J］.Int J Pharm,1981,9:165-172.