紫菀的毒性部位及对小鼠的急性肝损伤作用研究

紫菀(Radix Asteris)为菊科植物紫菀Aster tataricus L. f.的干燥根及根茎，辛、苦、温，具有润肺下气、消痰止咳的功效，用于痰多喘咳，新久咳嗽，劳嗽咳血[1]。历代本草及现代中医药专著均沿袭了其无毒的说法。本课题组前期研究中发现，紫菀水煎液灌胃给予小鼠有一定的急性毒性和肝脏毒性[2];进一步的研究表明，紫菀以90%乙醇提取毒性最强，通过毒性部位的追踪，发现其醋酸乙酯部位为紫菀的粗毒性部位(LD50为0.19 g/kg) [3]。本实验在前期工作的基础上，仍以小鼠急毒为筛选指标，对醋酸乙酯部位进一步细分，得到毒性成分更集中的部位，并首次研究其对小鼠的肝脏毒性。会计职称论文发表

　　1材料与仪器

　　1.1动物昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g，由南京青龙山实验动物中心提供。

　　1.2药物及试剂紫菀购自河北省安国市药材市场，经中国药科大学生药学研究室张勉教授鉴定，凭证标本保存于中国药科大学生药学研究室。提取溶剂为市售90%工业酒精;石油醚、醋酸乙酯、甲醇、氯仿均为市售分析纯;薄层色谱硅胶及柱色谱硅胶为青岛海洋化工厂生产。谷丙转氨酶测定试剂盒(ALT)，批号：20091112，谷草转氨酶测定试剂盒(AST)，批号：20091112，血清总胆红素测定试剂盒(TBIL)，批号：20091112，均为南京建成生物工程研究所产品。

　　1.3仪器旋转蒸发仪，瑞士Buchi实验仪器公司产品，型号：R-2000;数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品，型号：HH-4;电子天平，型号：PL303，Matter - Toledo Group;医用数控超声仪，型号：KQ - 250DE，昆山超声仪器有限公司产品。高速冷冻离心机，型号：TLG-16，湘仪集团;1500酶标仪，Thermo Electrom 公司产品。

　　2方法

　　2.1紫菀各部位的制备方法紫菀药材粉碎成粗粉，分别用10，8，8倍量90%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味的稠膏状，加水混悬，依次用石油醚和醋酸乙酯萃取，得到紫菀醋酸乙酯部位。取醋酸乙酯部位浸膏，采用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，各流分根据薄层色谱结果合并，得到A-1、A-2、A-3三个部分，各部分均以1 g/kg(浸膏量)给药，给药体积0.2 ml/10g，进行急性毒性实验。取A-2部位浸膏，采用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，收集各极性段的流分根据薄层色谱结果合并，得到Fr1、Fr2、Fr3三个部分。各部分均以0.4 g/kg(浸膏量)给药，给药体积0.2 ml/10g，进行急性毒性实验。会计职称论文发表

　　2.2急性毒性实验方法健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组10只。实验前禁食12 h，不禁水，灌胃给予相应的药物，一次给药;空白组给以相同体积的0.5% CMC-Na。给药0.5 h后开始观察小鼠的中毒体征。连续7 d观察小鼠死亡情况，随时取出死亡小鼠，记录死亡时间。

　　2.3紫菀毒性部位小鼠LD50测定实验由预实验测得紫菀毒性部位的LD0和LD100分别为0.023 g/kg和0.10 g/kg，由此确定组间剂量比值为0.75，即Fr2部位0.023，0.030，0.040，0.053，0.071，0.10 g/kg共6组(分别编为1，2，3，4，5，6组)。

　　2.4紫菀毒性部位急性肝损伤实验健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组10只。灌胃给予LD0剂量的紫菀毒性部位，给药体积0.2 ml/10g，空白组给予相同体积的0.5% CMC-Na溶液。给药后禁食12 h，不禁水，摘眼球取血，3 500 r/min离心10 min，取血清备用，解剖取肝脏，10%福尔马林溶液固定，HE染色，进行组织病理学检查。按照试剂盒说明书操作测定血清中谷丙转换酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)的含量。实验数据采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。　健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组10只。灌胃给予LD100剂量的紫菀毒性部位，给药体积0.2 ml/10 g，空白组给予相同体积的0.5% CMC-Na溶液。给药组待小鼠死亡后解剖取肝脏，10%福尔马林溶液固定，HE染色，进行组织病理学检查。　组织病理学检查判断标准：根据病变程度，记为“-”“+”“++”“+++”。“-”表示无明显病变;“+”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞约占25%，肝细胞点状坏死，肝小叶内或汇管区少量的炎细胞浸润及肝细胞增生;“++”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞约占50%，细胞碎片状坏死，小叶内或汇管区中等量的炎细胞浸润;“+++”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞数约占75%或以上，桥接状坏死或大片坏死，肝小叶内或汇管区大量的炎细胞浸润或淋巴滤泡形成。
3结果

　　3.1紫菀毒性部位的筛选小鼠经灌胃给药后，A-2组小鼠活动明显减少，精神萎靡，被毛蓬松潮湿，双目紧闭，尾巴、爪子呈现乌青色，不自主颤抖等现象，呼吸先快后慢，直至呼吸停止。给药后3~6 h为死亡高峰期，死亡现象均发生在24 h内。尸体解剖后，肉眼观察肝显黄色或白色斑点，表现为明显的肝中毒;其他组小鼠反应正常。急毒实验结果(表1)显示，A-2组小鼠给药后全部死亡，其他组未出现死亡，确定A-2有毒性。A-2细分的3组灌胃给药后，Fr2组小鼠体征表现同A-2组，急毒实验结果(表2)显示，Fr2给药小鼠全部死亡，其他组未出现死亡，故确定Fr2部位为紫菀的毒性部位。表1A-1、A-2、A-3给药小鼠急性毒性实验结果

　　3.2紫菀毒性部位小鼠LD50的测定实验紫菀毒性部位不同剂量灌胃给药后，小鼠死亡分布情况见表3，经计算得紫菀毒性部位LD50=0.052 g/kg，95%可信限为0.039~0.069 g/kg。

　　3.3紫菀毒性部位对小鼠血清生化指标的影响LD0剂量给药后，小鼠血清生化指标检测结果(表4)显示，与对照组相比，毒性部位Fr2组小鼠血清中ALT、AST值升高，TBIL没有显著性差异。表2Fr1、Fr2、Fr3给药小鼠急性毒性实验结果表3紫菀毒性部位不同剂量给药后小鼠死亡分布情况表4LD0剂量紫菀毒性部位对小鼠血清生化指标的影响

　　3.4紫菀毒性部位对小鼠肝脏组织形态影响LD0剂量单次给药，小鼠处死后解剖，肉眼观察肝脏呈鲜红色，质柔软，与空白组无明显差别;LD100剂量给药后，约3 h小鼠开始死亡，小鼠死亡后立刻取出尸体解剖，肉眼观察肝脏表面有黄色或白色斑点，肝脏颜色较空白组浅。组织病理学结果(图1)显示，与空白组(a)比较，LD0剂量组(b)小鼠肝小叶结构尚清楚，部分肝索排列紊乱，肝细胞呈轻度细胞水肿(+);可见肝细胞点状坏死(+)、肝小叶及汇管区见有炎细胞浸润(+)，纤维结缔组织增生不明显;LD100剂量组(c)小鼠肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，肝细胞呈不同程度脂肪变性、细胞水肿(++~+++);可见肝细胞坏死(+~++)、肝小叶及汇管区均见有炎细胞浸润(+)。纤维结缔组织增生不明显。a-空白组b-LD0剂量组c-LD100剂量组图1紫菀毒性部位对小鼠肝脏组织形态的影响会计职称论文发表

　　4讨论

　　紫菀始见于《神农本草经》，历代本草专著记载很多，但均未对其毒性有记载。《神农本草经》将其列为中品，仅记载其“味苦温”，《本草经集注》《本草纲目》等均有明确记载，曰“无毒”，仅《本草经疏》中提到“不宜专用及多用”。后世多接受典籍的记载，而认为紫菀无毒。

　　文献报道[4]，紫菀中所含的皂苷类成分由于具有溶血作用，粗制剂不宜注射用。本课题组的研究表明紫菀的水提物和醇提物均有毒性，且随着醇浓度升高毒性增强。本文以急性毒性为指标，对粗毒性部位即醋酸乙酯部位进行了进一步的追踪，得到了更为精制的毒性部位。紫菀所含主要化学成分为萜类及其皂苷、肽类、香豆素、蒽醌及黄酮类、有机酸及酚类等[5]，哪一类或哪几类化合物是毒性成分，以及是否与其有效部位及有效成分相同，还需深入研究。

　　本实验研究结果表明，紫菀毒性部位的LD50为0.052 g/kg，可见其毒性不容忽视。紫菀毒性部位采用小鼠单次灌胃给药，LD0剂量下可引起小鼠血清中ALT和AST升高，TBIL值没有差异性变化，推断低剂量下紫菀毒性部位可引起轻度肝损伤，但可能与胆汁淤积无关。组织病理学检查结果表明，LD0剂量下小鼠肝细胞呈轻度细胞水肿，可见肝细胞点状坏死，肝小叶及汇管区见有炎细胞浸润;LD100剂量下小鼠肝小叶结构破坏，肝索排列紊乱，肝细胞呈不同程度脂肪变性、细胞水肿，可见肝细胞坏死、肝小叶及汇管区均见有炎细胞浸润。说明单次给药后，LD0剂量下可引起小鼠肝脏轻微损伤，与生化指标测定结果一致，LD100剂量下可引起显著的急性肝损伤，并导致死亡。但其小剂量是否有毒性蓄积作用以及肝损伤机制，有待进一步研究。