莪术油注射液诱导人子宫内膜癌HEC-1-B 细胞凋亡机制研究

李伟宏1 ，田莉1 ，刘俊保2 1． 郑州澍青医学高等专科学校，河南 郑州 450064; 2． 河南省人民医院，河南 郑州 450003 摘要: 目的: 研究莪术油注射液对人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞体外增殖及相关蛋白表达情况的影响。方法: 将体外培养的 HEC-1-B 细胞随机分 5 组，对照组、莪术油Ⅰ组、莪术油Ⅱ组、莪术油Ⅲ组、莪术油Ⅳ组。分别给与不同浓度的莪术油注射液培养 48 h、72 h。采用 MTT 法检测 HEC-1-B 生长抑制率、Hoechest33258 荧光染色观察 HEC-1-B 细胞核形态的变化、Western blot 法检测相关蛋白的表达水平。结果: 不同浓度莪术油注射液均对 HEC-1-B 细胞增殖具有抑制作用，同时诱导 HEC-1-B 细胞凋亡，上调 Caspase-3 蛋白的表达，下调 Survivin 蛋白的表达，其强度随着药物作用浓度及时间的增加而增强，呈时间-剂量依赖性，与对照组比较，差异有统计学意义( P ＜ 0． 01) 。结论: 不同浓度莪术油注射液在一定浓度范围内可抑制 HEC-1-B 细胞生长，且诱导其凋亡，其机制可能与下调子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞 Survivin 蛋白的表达，上调 Caspase-3 蛋白的表达有关。文献引用: 李伟宏，田莉，刘俊保． 莪术油注射液诱导人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞凋亡机制研究［J］． 中医学报，2016，31 ( 10) : 1451 － 1454．关键词: 莪术油注射液; 子宫内膜癌; 肿瘤; HEC-1-B 细胞; 细胞凋亡; Caspase-3 蛋白; Survivin 蛋白; 实验研究 DOI: 10． 16368 /j． issn． 1674 － 8999． 2016． 10． 409 中图分类号: Ｒ273． 733 文献标志码: A 文章编号: 1674 － 8999( 2016) 10 － 1451 － 04 Ｒesearch on Zedoary Turmeric Oil Injection Induction of Human Endometrial Carcinoma HEC-1-B Cell Apoptosis and Its Mechanism LI Weihong1 ，TIAN Li1 ，LIU Junbao2 1． Zhengzhou Shuqing Medical College，Zhengzhou Henan China 450064; 2． Henan Provincial People's Hospital，Zhengzhou Henan China 450003 Abstract: Objective: To study the effect of zedoary turmeric oil injection on human endometrial carcinoma ( HEC-1-B) cell proliferation and expression of related protein influence． Methods: HEC-1-B cells cultured in vitro were randomly divided into 5 groups， control group，Ⅰ，Ⅱ of zedoary turmeric oil of zedoary turmeric oil and zedoary turmeric oil Ⅲ，zedoary oil Ⅳ． They were treated with different concentrations of zedoary turmeric oil injection 48 h，72 h training． MTT assay was used to detect the growth inhibition rate of HEC-1-B，Hoechest33258 fluorescence staining to observe the changes of HEC-1-B cell nucleus，and the expression level of Western blot protein． Ｒesults: Different dose of zedoary turmeric oil injection had inhibitory effect on HEC-1-B cells，and at the same time，inducing HEC-1-B cell apoptosis，raising Caspase 3 protein expression，reducing Survivin protein expression，and its intensity increased with the increase of the concentration and time of the drug action，which showed a time-dose dependence，and the difference was statistically significant compared with the control group( P ＜ 0． 01) ． Conclusion: Different concentrations of zedoary turmeric oil injection could inhibit the growth of HEC-1-B cells in a certain concentration range，and inducing its apoptosis， the mechanism may be related to the down-regulation of HEC-1-B expression of Survivin protein in endometrial carcinoma cells， · 1541 · 2016 年 10 月 1 日 第 10 期 No． 10 1 October 2016 中 医 学 报 ACTA CHINESE MEDICINE 第 31 卷 总第 221 期 Vol． 31 Serial No． 221 the up-regulated expression of Caspase-3 protein．Ｒeference citation: LI Weihong，TIAN Li，LIU Junbao． Ｒesearch on Zedoary Turmeric Oil Injection Induction of Human Endometrial Carcinoma HEC-1-B Cell Apoptosis and Its Mechanism［J］． Acta Chinese Medicine，2016，31( 10) : 1451 － 1454． Key words: zedoary turmeric oil injection; endometrial cancer; tumor; HEC-1-B cell; apoptosis; Caspase-3 protein; Survivin protein; experimental study 子宫内膜癌是发生于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，以腺癌最为常见，其发生率约居我国女性生殖系统恶性肿瘤的第 3 位，居西方国家女性生殖系统恶性肿瘤的首位［1］。近年来发病率呈上升趋势。近年来，中草药对恶性肿瘤的辅助治疗有了新进展，已引起人们的广泛关注。莪术油是从姜科植物莪术的干燥根茎中提取的挥发油成分。大量研究证实，莪术油对实体肿瘤的辅助治疗具有良好的效果且无明显不良反应［2-3］。但莪术油抑制子宫内膜癌细胞生长并诱导其凋亡的研究未见报道。因此，笔者拟通过体外实验来观察莪术油作用于人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞的疗效并分析其机制，为子宫内膜癌的临床辅助治疗提供理论和实验依据。 1 材料与方法 1． 1 细胞株 人子宫内膜癌细胞( HEC-1-B) 由辽宁医学院惠赠。 1． 2 药物及试剂 DMEM 培养液; 1∶250 胰蛋白酶; 标准胎牛血清( standard FBS，杭州四季青生物制品公司，批号: 20150520) ; Annexin V-FITC 试剂盒 ( 晶美生物工程有限公司) ; Caspase-3、P21、Bcl-2、 Bcl-XL、CyclinB 和 Survivin、碘化丙啶( propidiumiodine，PI) 均为美国 Sigma 公司产品; β-肌动蛋白( β- actin) 抗体: Beyotime 试剂公司; NBT /BCIP 显色液: Beyotime 试剂公司; 莪术油注射液( Zedoray Turmic Oil Injection) : 徐州莱恩药业有限公司，规格: 10 mL: 莪术油 0． 1 g，国药准字 H20067076。 1． 3 实验方法 1． 3． 1 细胞增殖的测定( MTT 法) 从 CO2 孵箱中取出 HEC-1-B 细胞，随机分 5 组，对照组、莪术油 Ⅰ组、莪术油Ⅱ组、莪术油Ⅲ组、莪术油Ⅳ组。用消化液将其制成 5 × 106 L － 1的细胞悬液，接种于 96 孔培养板对其进行培养。各孔添加细胞悬液 200 μL，孵育 24 h 后弃去容器中的旧培养液，莪术油组分别更换含体积分数 20% 胎牛血清的 DMEM 培养液配制的浓度为 120 μmol·L － 1、240 μmol·L － 1、480 μmol·L － 1、960 μmol·L － 1的莪术油，每孔 0． 2 mL，各设 5 个复孔，对照组 5 孔加入体积分数 10% 标准胎牛血清，每孔 0． 2 mL。由于莪术油具有挥发性，所以使用时即刻配置; 分别于培养 48 h、72 h 后弃上清，结束培养前 4 h 添加 MTT 每孔 10 μL。吸去孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜 100 μL，摇床上溶解振荡 15 min，待结晶物充分溶解后，酶标仪检测各孔吸光度( OD 值) ，并记录结果。实验重复 3 次。 1． 3． 2 Hoechst33258 荧光染色检测 HEC-1-B 细胞凋亡小体 用体积分数 0． 125% 胰蛋白酶将对数期贴壁生长细胞消化并制作成单细胞悬浮液，控制其密度为 5 × 106 L － 1，接种于放有盖玻片的 24 孔培养板，每孔 1． 5 mL。37 ℃，5% CO2 孵箱孵育 24 h 后，待细胞贴壁 展 开 更 换 含 有 体 积 分 数 20% 胎 牛 血 清 的 DMEM 培 养 液，分 别 设 对 照 组、莪 术 油Ⅰ组 ( 120 μmol·L － 1 ) 、莪术油Ⅱ组( 240 μmol·L － 1 ) 、莪术油 Ⅲ 组 ( 480 μmol · L － 1 ) 、莪 术 油 Ⅳ 组 ( 960 μmol·L － 1 ) ，每组 4 个复孔。进行 48 h 的培养后弃掉培养液，采用冷的 PBS 溶液进行 3 次清洗，加入体积分数 4% 的多聚甲醛溶液固定 30 min 弃掉，再用冷的 PBS 溶液重复清洗 3 次，在避光条件下用 5 mg·L － 1 Hoechst33258 的溶液处理 15 min 弃掉，再次用 PBS 溶液冲洗，然后利用荧光显微镜观测细胞核，如果观察到细胞核发生碎裂、固缩、荧光强度增加和形成凋亡小体等现象即可说明细胞凋亡。 1． 3． 3 Western blot 法检测 HEC-1-B 细胞内相关蛋白的表达 用体积分数 0． 125% 胰蛋白酶将对数期贴壁生长细胞消化并制作成单细胞悬浮液，控制其密度为 5 × 106 L － 1，接种于放有盖玻片的 24 孔培养板，每孔 1． 5 mL。37 ℃，体积分数 5% CO2 孵箱孵育 24 h 后，待细胞贴壁展开更换含有体积分数 20% 胎牛血清的 DMEM 培养液，分别设对照组、莪术油Ⅰ组 ( 120 μmol·L － 1 ) 、莪术油Ⅱ组( 240 μmol·L － 1 ) 、莪术油Ⅲ 组 ( 480 μmol · L － 1 ) 、莪 术 油 Ⅳ 组 ( 960 μmol·L － 1 ) ，每组 4 个复孔。将蛋白印迹显影图扫描，利用凝胶自动分析成像软件 Chem Image5500 对蛋白带进行灰度值分析。 · 2541 · 2016 年 10 月 1 日 第 10 期 No． 10 1 October 2016 中 医 学 报 ACTA CHINESE MEDICINE 第 31 卷 总第 221 期 Vol． 31 Serial No． 221 1． 4 统计学方法 采用 SPSS 20． 0 统计软件进行统计分析，对资料进行单因素方差分析。计量资料以均数 ± 标准差( x珋± s) 表示，采用 t 检验，计数资料采用 χ 2 检验，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。 2 结果 2． 1 不同浓度莪术油注射液对 HEC-1-B 细胞增殖的影响 四种浓度为 120 μmol·L － 1、240 μmol· L － 1、480 μmol·L － 1、960 μmol·L － 1 莪术油注射液分别在 48 h、72 h 对体外培养的子宫内膜癌 HEC-1- B 细胞的增殖具有抑制作用，其强度随着药物作用浓度及时间的增加而增强，呈时间一剂量依赖性，见图 1。与 对 照 组 比 较，差异有统计学意义 ( P ＜ 0. 01) 。图 1 不同浓度莪术油注射液对 HEC-1-B 细胞增殖的影响 2． 2 不同浓度莪术油注射液对 HEC-1-B 细胞凋亡的影响 各组作用 48 h 后，荧光显微镜观察发现，与对照组比较，莪术油各组细胞均出现细胞核固缩、细胞核碎裂、荧光强度增强等凋亡特征，以莪术油Ⅰ 组为例，见图 2。注: A: 对照组; B: 莪术油Ⅰ组图 2 莪术油对 HEC-1-B 细胞核形态的影响( × 400) 2． 3 不同浓度莪术油注射液对 HEC-1-B 细胞内相关蛋白表达影响 经 Western blot 检测 Survivin 蛋白，与对照组比较，不同浓度的莪术油注射液作用 48 h 和 72 h 后，HEC-1-B 细胞的 Survivin 蛋白表达水平均较对照组不同程度的降低，并随莪术油浓度及时间的增加而递减，呈时间一剂量依赖性。见图 3、图 4。Western blot 检测 caspase-3 蛋白，与对照组比较，不同浓度的莪术油注射液作用 48 h 和 72 h 后，HEC-1-B 细胞的 caspase-3 蛋白表达水平均较对照组不同程度的升高，并随莪术油浓度及时间的增加而递增，呈时间一剂量依赖性( P ＜ 0． 01) 。图 3 各组 HEC-1-B 细胞 Survivin 蛋白电泳图图 4 不同浓度莪术油对 HEC-1-B 细胞 Survivin 蛋白表达的影响图 5 各组 HEC-1-B 细胞 caspase-3 蛋白电泳图图 6 不同浓度莪术油对 HEC-1-B 细胞 caspase-3 蛋白表达的影响 3 讨论肿瘤是个古老的疾病。自殷墟出土的甲骨文中，就有“瘤”的记载。汉代刘熙《释名》定义为“瘤，流也，血流聚生而瘤肿也。”周代有疡医之位，其主治范围包括“肿疡”，即肿瘤类疾病。子宫内膜癌相当于中医学的“癥瘕”，唐代孙思邈《千金要方》中载有明确的病机，明确其病位在下焦，为腹中积块，或胀或痛的疾病，并有固定的方药。《黄帝内经》认为 “正气存内，邪不可干。”本病的基本病机是正气亏虚，热毒内聚，气滞血瘀。治疗原则是解毒化瘀，扶正消积。中医药不良反应较小，莪术具有破血逐瘀作用，单用可缩小瘤体，改善全身状况，提高生存质量［3-7］，莪术油可抑制 HEC-1-B 细胞增殖，并促进其细胞凋亡。近年来，细胞凋亡的生物学作用在恶性 · 3541 · 2016 年 10 月 1 日 第 10 期 No． 10 1 October 2016 中 医 学 报 ACTA CHINESE MEDICINE 第 31 卷 总第 221 期 Vol． 31 Serial No． 221 肿瘤发展过程中受到普遍关注。 Survivin 基因是新近分离鉴定的凋亡抑制蛋白 ( inhibitor of apoptosis，IAP) 分子，在人类很多肿瘤组织中 Survivin 基因表达很高，而在健康成人组织中 Survivin 基因不表达［8］，Survivin 基因和其他凋亡抑制基因的不同主要是由于其独特的分子结构和分布。Survivin 基因编码产生含 142 个氨基酸的蛋白， Survivin 基因阻断细胞凋亡的作用是通过 Caspase-3 和 Caspase-7 的活性实现的［9-10］。Caspase 家族是诱导细胞凋亡的关键，Caspase 家族的激活与超常的蛋白表达均能诱导细胞凋亡，同时 Caspase 家族还可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡。 Caspase-3 是 Caspase 家族中最重要的成员［11-13］。许多诱导细胞凋亡的机制最终均需要通过 Caspase 介导的信号转导途径实现。Survivin 基因是功能强大的凋亡抑制基因，其抗细胞凋亡的作用是通过在凋亡通路的下游抑制 Caspase-3 的活性来实现的［14］。实验研究发现，莪术油注射液对人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞有诱导其调亡的作用，并且这种作用与莪术油注射液的浓度和作用的时间有一定的依赖关系。随着莪术油注射液浓度和作用时间的增加，诱导凋亡的人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞就越多。同时荧光染色发现经莪术油注射液处理的人子宫内膜癌 HEC-1- B 细胞细胞核固缩，染色质凝聚，出现凋亡小体。随着作用于人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞的莪术油注射液浓度的增加，细胞所表达的抑制细胞凋亡的 Survivin 蛋白浓度的也随之减少，并且通过 Western Blot 检测发现，Survivin 表达的多少也与莪术油注射液的浓度和作用的时间有关。同时，随着作用于人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞的莪术油注射液的浓度和作用时间的增加，细胞所表达的 Caspase-3 蛋白量也随之增加，也有一定的时间-剂量依赖性。本研究中人子宫内膜 HEC-1-B 细胞的凋亡，可能与莪术油注射液诱导 HEC-1-B 细胞中内源性凋亡抑制蛋白家族中 Survivin 蛋白的表达下调以及使凋亡途径中末端蛋白酶 Caspase-3 蛋白的上调有关，这与 Laura Bongiovanni 研究相一致［15］。因为 Survivin 蛋白有抑制人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞中控制细胞调亡的 Caspase-3 蛋白从酶原活化形成活性酶的作用，所以随着 Survivin 蛋白的表达下调，人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞中的 Caspase-3 蛋白得以激活，促进人子宫内膜癌 HEC-1-B 细胞的调亡程序的启动。综上所述，莪术油注射液诱导子宫内膜癌细胞凋亡，其机制可能与下调 Survivin 蛋 白，上 调 Caspase-3 蛋白有关，但是其具体的分子机制尚需进一步探讨。参考文献: ［1］Greenlee ＲT，Hill-Harmon MB，Murray T，et al． Cancer statistics［J］． CA Cancer J Clin，2001，51( 1) : 15 － 36．［2］徐立春，边可君，刘志敏，等． 天然药物莪术醇抑制肿瘤细胞生长及 ＲNA 合成影响的初步研究［J］． 肿瘤，2005，25( 6) : 570．［3］刘俊保，岳静宇，唐引引． 冬凌草甲素对 EC9706 细胞增殖、凋亡的影响［J］． 郑州大学学报: 医学版，2014，49( 1) : 8 － 11．［4］张鸿宇，周建忠． 穴位注射治疗恶性肿瘤机理初探［J］． 中医学报，2010，25( 5) : 826．［5］沈秋萍． 针灸治疗癌痛的展望［J］． 河南中医，2008，28( 6) : 84．［6］吴孟超． 中医药在肝癌防治中的作用、地位和存在的问题［J］． 中西医结合学报，2003，1( 3) : 163．［7］李学锋． 中西医结合治疗恶性胸水 30 例［J］． 河南中医，2008，28 ( 10) : 61 － 62．［8］Schattner E J，Friedman S M，Casali P． Inhibition of Fas-mediated apopt osis by antigen: implications for lymphomagenesis［J］． Autoimmunity，2002，35( 4) : 283 － 289．［9］Wang J，Zhang X，Wei P，et al． Livin，Survivin and Caspase-3 as early recurrence markers in non-muscle-invasive bladder cancer［J］． World J Urol，2014，32 ( 6) : 1477 － 1484．［10］Bergeron L J，Ouellet J，Perreault J P． Ｒibozyme-based gene-inactivat ion systems require afine comprehension of their substrates pecificities; 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