相关序列扩增多态(SRAP)在农作物遗传育种中的应用

论文网（www.lunww.com )是学术期刊推广、学术论文发表、论文创作指导的正规代理机构,我们与4、5百家省级、国家级、核心期刊有合作,我们合作的期刊都是万方、维普、中国知网、中国新闻出版总署收录的正规期刊。合作的期刊中国新闻出版总署可查,详情可来电0519-83865052,或者QQ：85782530咨询。

　AbstractSequence-Related Amplified Polymorphism(SRAP) is a new kind of DNA molecular markers,which possesses characteristics such as simplicity,reliability,high co-dominance and easily getting sequence of selected bands. SRAP principles and protocols were described and its research advances and application in such aspects as genetic mapping,genetic diversity,gene tagging and so on were overviewed.
　　Key wordsSequence-Related Amplified Polymorphism;principles;genetic mapping;genetic diversity;gene tagging
　　
　　我国有丰富的农作物品种,但天然品种总是在某些性质方面存在缺陷,如容易受到病虫害感染、产量低等。因此,选育和推广优质的农作物新品种是农作物研究的重要任务。分子标记辅助育种是利用分子遗传标记,借助于目标基因紧密连锁的遗传标记的基因型分析鉴定含有目标基因的个体,从而提高选择效率,减少盲目性,加速育种进程,在一定程度上弥补了传统育种缺陷[1]。
　　目前,用于植物基因组分析的分子标记有RFLP(restr-ication fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性)、RAPD(random amplified polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性)、SSR(simple sequence repeat,简单重复序列)、SRAP(sequence-related amplified polymorphism,相关序列扩增多态)等。其中RFLP标记虽然以共显性方式遗传,但由于它对DNA需求量大、实验操作较繁琐、检测周期长、成本费用高等限制了其广泛引用;RAPD方法虽然简单易行,需DNA量极少,但由于RAPD标记是一个显性标记,不能识别纯合子和杂合子,且其操作重复性较差;SSR具有高度的多态性、共显性遗传、选择中性、易于操作等优点,但SSR座位的筛选和特异引物的开发工作繁琐且耗时费力,限制了其广泛应用;AFLP技术发挥了检测位点多、多态水平高、灵敏度高、结果稳定可靠等优点,但其操作要求严格,扩增时会有假阳性和假阴性结果以及凝胶背景杂乱等缺点,在一定程度上影响了其标记作用的良好发挥;而SRAP是一种新型的基于PCR的标记技术,它的特点在于不需要知道任何基因的序列信息即可进行PCR扩增,集中了上述几种标记技术的优点,具有共显性、简便、稳定、操作简单、重复性强、中等产率等优点,可以弥补以上各项技术的不足,在多种植物研究中得到了广泛的应用,体现了SRAP标记技术在植物研究中的可行性。
　　1SRAP标记简介
　　SRAP标记是由美国加州大学作物系Li[2]于2001年在研究芸薹作物时开发出来的一种标记技术,在油菜、水稻、小麦、棉花等农作物上的研究已体现出一定的应用价值[3-7]。
　　1.1SRAP标记原理
　　SRAP主要对植物基因组中ORFs(open reading frames,开放阅读框)进行扩增,利用外显子富含GC而启动子、内含子富含AT的特点设计引物。上游引物(也叫正向引物,forward primer)长17 bp,引物的3′端为3个选择碱基,引物的5′端为14 bp的核心序列,由一段填充序列和CCGG构成,主要结合在外显子区域,对外显子进行特异扩增。下游引物(也叫反向引物,reverse primer)长18 bp,引物的3′端仍为3个选择碱基,引物的5′端为14 bp的核心序列,其中核心序列前11 bp是一段填充序列,紧接着是AATT,下游引物的结合位点在内含子区域或启动子区域,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。由于内含子、启动子与间隔序列长度在物种间或同一物种的不同个体间是不等的,因此用SRAP分析时会产生多态性[2]。
　　1.2DNA扩增
　　DNA扩增采用复性变温法扩增,主要是为了保证引物与靶DNA配对,并且保证扩增片段的重复性。反应体系中包括DNA 150 ng、dNTPs 0.2 mmoL/L、1.5 mmoL/L MgCl2、0.3 μmoL/L引物、1 U TaqDNA聚合酶。反应参数:94 ℃预变性5 min;循环30次,前5次循环:95 ℃变性30 s,35 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s;后25次循环:94 ℃变性30 s,50 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s,循环结束后72 ℃延伸7 min[8]。不同的物种进行SRAP-PCR扩增的最优条件并非相同,因此在进行具体研究时应对PCR中反应体系进行优化,对相关参数做浓度梯度研究以确定研究对象的最优扩增条件,达到最好的反应效果[9]。
　　1.3产物检测
　　扩增产物通常用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,也可用琼脂糖检测多态性。分离完毕后用放射自显影方法、银染方法或EB方法检测[8]。
　　2SRAP技术在农作物遗传育种中的应用
　　近年来,由于SRAP引物的大量开发,并且在分子标记辅助育种中体现出了优于AFLP、ISSR、RAPD等特点[10-11],因此备受遗传育种学家的青睐,被广泛应用于农作物遗传多样性评价、遗传图谱构建和品种鉴定等方面。2.1遗传多样性研究
　　遗传多样性是指物种中不同个体遗传变异的总和。遗传多样性的研究是植物种质资源保护、品种改良和开发利用的基础。分析种质资源的遗产多样性,探讨遗传基础和亲缘关系,为种质资源的利用提供理论基础。何凤发等[12]随机选用了27对SRAP引物对44份马铃薯(Solanum tubero-sum)资源进行遗传多样性分析,有23对引物可产生104条多态性条带,平均每对引物产生4.5个多态性条带,表明SRAP标记有较高的多态性比率,多态性丰富,可用于马铃薯遗传多样性的分析。李晓慧等[13]采用SRAP分子标记对西瓜(Citrullus lanatus)进行遗传多样性分析,8对引物组合共产生多态性条带37条,平均4.7条,每对引物平均多态性比率为28.675%,结果表明SRAP标记具有较高的多态性,适合于分析西瓜等遗传差异小的物种。
　　2.2标定基因
　　标定基因对于后基因组学的研究和作物育种具有重要意义。育种工作的目的就是实现品种改良,品种改良的实质就是对目的基因进行选择并实现优异基因集成的过程。因而实现目的基因的快速定位、提高其选择效率,是加快育种进程的关键。农作物的一些重要性状都是由一个或多个基因决定的。如果能够找到与目的性状相关联的基因或是找到与目的基因连锁的分子标记,在杂交育种时就可以有目的地选择亲本,并且对于子代可以快速地鉴定,提高育种效率。在甘蓝型油菜(Brassica napus)的育种过程中,选择黄色籽粒是一个重要的任务。Fu等[14]利用SRAP分子标记对在不同环境中生长的2个重组品系的杂交品种进行分析,发现了19个数量相关性状基因,其中一个主要的基因与标记EM11ME20/200相邻,通过比较基因组学分析发现这个重要的QTL基因两侧的标记序列与拟南芥第5条染色体中定位于At5g44440基因和At5g49640基因间的一个重要的QTL基因的两侧序列有高度的同源性。
　　产量性状是复杂的数量性状,对油菜产量性状进行分析,可确定其在染色体上的位置及其遗传效应,可以探讨油菜杂种优势产生原因,提高育种中对产量性状优良基因型选择的效率。Chen等[15]对油菜的双单倍体群体和F2群体进行SRAP分析,发现了与6个生产性状相关的QTL基因,包括植株高度、最低有效分枝的高度、主花序长度、角果长度、有效分枝数和角果密度,在某些染色体的区域中有多个性状的QTL,与观察到的部分表型性状的相关性是一致的,表明QTLs的紧密连锁是相关性遗传的基础。燕麦是人们常用的谷物,但是现在在谷物生长的土壤中经常会含有一些重金属物质,如镉。镉是非必需的重金属,在低浓度时对细胞就是高毒性的,而植物自身有一套机制可以负责镉的解毒,并控制镉的含量,但是对于同一种植物的不同品种可能由于遗传因素的原因,它们的镉含量是有差异的,因此培育低镉含量的植物是育种的重要目标,试图找到与低镉含量连锁的分子标记,作为表型选择的依据。在对燕麦(Avena sativa)的分析中运用混合群分离分析,发现了4个与镉含量相关的分子标记:1个SRAP,2个RAPDs,1个REMAP,这4个标记同属于一个连锁群,代表着与谷物镉含量密切相关的质量性状位点[16]。
　　2.3构建遗传图谱
　　遗传图谱是确定基因或DNA标志在染色体上的相对位置和遗传距离,是研究基因组遗传与变异的重要手段。衡量遗传图谱质量的一个重要标准是标记分布的均匀程度,而标记类型是影响连锁群上的标记均匀分布与否的重要因素之一。李媛媛等[17]利用SRAP、SSR和AFLP 3种分子标记技术对甘蓝型油菜进行遗传分析,构建了1张包含21个连锁群的遗传图谱,其中涉及137个SRAP标记、143个SSR标记和118个AFLP标记,图谱长1949.8 cM。在此研究中,虽然SSR和SRAP标记在图谱上呈间隔分布,并且在所有21条连锁群上,仅N7连锁群上的标记分布不均匀,但SSR标记仅分布于非编码区,并且开发费时费力;AFLP标记与SRAP标记相比,AFLP标记操作复杂,需要经过酶切、连接等步骤,成本较高,并且AFLP容易密集分布,在研究中约有1/2的AFLP标记仅分布在4条连锁群上。因此,相比之下SRAP更适合于图谱构建。Sun等[18]利用1 634对SRAP引物组合对双单倍体甘蓝型油菜群体作图,共产生了13 551条SRAP条带,构建的遗传图谱中基本上每1 cM就有8.45个SRAPs,比物理图谱中每100 kb出现1个标记的频率更高,是一张高密度的遗传图谱,这表明单一的SRAP标记对构建遗传图谱是适合的。
　　2.4品种鉴定
　　由于育种工作的大力推广与开展,几乎每个农作物中都培育了很多品种,有些品种从形态上看较为相似,并且也存在同物不同名的现象。为了有效地区分这些品种就必须建立分子鉴别机制。王燕等[19]利用15个引物组合对番茄(Cyphomandra betacea)11个主要品种以及1个近缘野生种进行种质鉴定的SRAP分析,双引物组合me8/em8-1与me6-1/em14-1可以区分所有供试材料,表明SRAP可有效用于番茄品种资源鉴定。Hao等[20]利用24对SRAP引物组合对芍药属(Paeonia)的29份栽培品种进行研究,这29份品种分别属于不同组,有14个为芍药组植株,有13个为牡丹组植株,还有2个芍药组和牡丹组的杂交植株,扩增共产生了197条带,其中187条多态性条带。扩增条带结果显示,用独特的扩增条带和特殊的引物组合鉴定芍药栽培品种是有效的,可以用35条SRAP条带把14个芍药栽培品种两两相互区分,并且还通过Me8/Em8和Me8/Em1这2对引物组合把芍药和牡丹样品全部分离。
　　3展望
　　综上可以看出,SRAP标记已被应用到农作物研究的很多领域,是一种简单有效的分子标记。与其他分子标记相比,由于SRAP标记扩增对象是基因组中的开放阅读框,可以体现开放阅读框区域的多态性,也可更好地解释物种性(下转第82页)
　　(上接第80页)
　　状差异的原因。对研究中获得的SRAP差异片段可以测序,把它转化成SCAR(sequence characterized amplified region)标记,这将更加有利于种质资源的筛选鉴定工作。总之,相信随着检测手段的精确度不断提高和分析方法的逐步改进,SRAP标记会更加完善、更为广泛地用于物种分子遗传水平的研究。
　　4参考文献
　　[1] 邓丽琴,祝朋芳,陈长青.试论常规育种与分子育种的研究应用[J]. 杂粮作物,2004,24(5):280-281.
　　[2] LI G,QUIROS C F. Sequence-related amplified polymorphism(SRAP),A new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet,2001(103):455-461.
　　[3] 陈峰,张洁夫,陈松,等.甘蓝型油菜隐性核不育基因的SRAP标记[J].江苏农业学报,2007,23(4):283-288.