酸枣仁粉碎前后对酸枣仁皂苷A含量和安神功效的影响

 酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var. spinosa(Bunge)的干燥成熟种子,始载于《神农本草经》,具有补肝宁心、敛汗生津的作用,用于虚烦不眠、惊悸多梦、体虚多汗、津伤口渴等证[1],是临床中医常用的安神要药。现代研究认为,酸枣仁皂苷A为酸枣仁的活性成分,具有较强的镇静、催眠作用[2]。目前,北京各大医院中药房所使用的酸枣仁有的是经过粉碎的,有的没有粉碎。为了研究粉碎与未粉碎的酸枣仁在水煎煮过程中有效成分含量以及安神作用是否有差异,更好的指导临床合理用药,我们进行了以下试验。

　　1  材料

　　1.1  试药

    酸枣仁(炒)购于北京同仁堂(亳洲)饮片有限责任公司；酸枣仁皂苷A购自中国药品生物制品检定所(批号110734- 200407)。甲醇为色谱纯,水为去离子水,其余试剂均为分析纯。安定,天津力生制药股份有限公司,批号0703004；戊巴比妥钠,北京化学试剂公司,批号020919。

　　1.2  动物

    昆明种小鼠,体重18～22 g,雌雄各半,中国人民解放军总医院动物实验中心,动物合格证号：SCXK(京)2004-0001。论文发表网

　　1.3  仪器

    Agilent1100高效液相色谱仪,Alltech蒸发光散射检测器,G1311A泵,手动进样器,G1379A脱气泵,Agilent chemstation for LC工作站；JZZ98-CM动物自主活动监测仪。

　　2  酸枣仁皂苷A含量测定

　　2.1  色谱条件

    Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为甲醇-水(65∶35),流速1.0 mL/min,蒸发光散射检测器,漂移管温度110 ℃,载气流速2.4 L/min。

　　2.2  对照品溶液的制备

    取酸枣仁皂苷A对照品适量,精密称定,置10 mL容量瓶中,加甲醇溶解,定容,制成0.52 mg/mL的酸枣仁皂苷A溶液。

　　2.3  供试品溶液的制备

    挑选颗粒饱满、大小均匀的酸枣仁(炒),用铜铳粉碎后,过12目筛。精密称取粉碎后的酸枣仁100 g,加蒸馏水回流提取3次,第１次加7倍量溶媒回流1.5 h,第2次加6倍量溶媒回流1 h,第3次加5倍量溶媒回流1 h。提取液过滤,合并,浓缩至每毫升溶液含0.25 g原药材。将浓缩液以2 000 r/min 离心20 min,取上清液,上SP825大孔吸附树脂柱,先用4 BV蒸馏水洗脱,水洗脱液弃去,再用4 BV的80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,回收乙醇至无醇味,经冷冻干燥后,得干燥物。精密称取干燥物适量,加甲醇溶解,定容至5 mL容量瓶中,得样品Ⅰ,备用。

    挑选颗粒饱满、大小均匀的酸枣仁(炒),不经粉碎,精密称取100 g,按样品Ⅰ的制备过程,得样品Ⅱ,备用。

    挑选颗粒饱满、大小均匀的酸枣仁(炒),经粉碎机粉碎后,精密称取10 g。用石油醚回流脱脂2次,石油醚弃去,药渣挥去石油醚至干；再用甲醇回流提取2次,第1次用8倍量溶媒回流2 h,第2次用7倍量溶媒回流1.5 h。提取液过滤,合并,用旋转蒸发仪回收甲醇至干,再加甲醇少量多次溶解干燥提取物,转移至10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得样品Ⅲ,备用。

　　2.4  线性关系考察

    精密吸取对照品溶液(0.52 mg/mL)2、4、6、8、10、12 μL,按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标,以酸枣仁皂苷A进样量为横坐标进行线性回归,得回归方程：Y＝1.288 8X＋5.889 8,r＝0.999 3。结果表明,酸枣仁皂苷A在1.04～6.24 μg范围内呈良好的线性关系。论文发表网

　　2.5  精密度试验

    精密吸取对照品溶液,连续测定5次,酸枣仁皂苷A色谱峰面积的RSD＝0.87%,表明精密度良好。
2.6  重复性试验

    取同一批次酸枣仁药材,按照“2.3”项下样品Ⅰ制备方法制备供试品溶液5份,测定酸枣仁皂苷A含量,结果平均含量为0.009 03%,RSD＝1.59%,表明重复性良好。

　　2.7  稳定性试验

    取同一供试品溶液,于0、30、60、120、240、480 min分别进样,酸枣仁皂苷A色谱峰面积的RSD＝1.61%,表明供试品在8 h内测定,结果稳定。

　　2.8  加样回收率试验

    采用加样回收法,精密称取5份已知含量的样品,分别加入一定量的对照品,按供试品溶液制备方法和色谱条件进行测定并计算回收率。结果见表1。表1  加样回收率试验结果(略)

　　2.9  样品测定

    将各供试样品溶液按上述色谱条件测定并计算含量。结果表明,未经粉碎的酸枣仁,用水回流提取,其样品中未检测到酸枣仁皂苷A；粉碎后的酸枣仁用水或甲醇提取,其样品中均检测到酸枣仁皂苷A,但前者的含量远低于后者。结果见表2。表2  样品中酸枣仁皂苷A的含量测定结果(略)论文发表网

　　3  对安神功效的影响

　　3.1  与戊巴比妥钠协同睡眠试验
   
　　取昆明种小鼠40只,雌雄各半,按性别、体重随机分为4组,每组10只。其中空白对照组每只给予等体积的生理盐水,阳性对照组(安定组)给予安定水溶液灌胃,两个试药组分别给予粉碎后的酸枣仁及未粉碎的酸枣仁提取液,连续给药10 d。于末次给药前8 h禁食,前1 h禁水,末次给药30 min后,腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg,观察并记录各组小鼠睡眠持续时间。结果见表3。表3  受试药物对小鼠戊巴比妥钠催眠作用的影响(略)注：与阴性对照组相比,*P<0.05,**P<0.01(下同)

　　3.2  小鼠自主活动试验

    取昆明种小鼠40只,雌雄各半,按性别、体重随机分为4组,每组10只。其中空白对照组每只给予等体积的生理盐水,安定组每只给予安定水溶液灌胃,两个试药组分别给予粉碎后的酸枣仁及未粉碎的酸枣仁提取液,连续给药10 d。末次给药30 min后,将小鼠置JZZ98-CM动物自主活动监测仪中,使其适应3 min后,记录5 min内活动次数。分别记录给药30、90 min后的自主活动情况。结果见表4。 表4  受试药物对小鼠自主活动的影响(略)

　　4  讨论

    从含量测定结果可以看到,在水提取过程中,经过粉碎处理的酸枣仁可以检测到酸枣仁皂苷A,未经粉碎处理的酸枣仁未检测到酸枣仁皂苷A。这可能是因为酸枣仁质地比较坚硬,种皮紧密,虽然经过了炒制的过程,但未经粉碎的酸枣仁有效成分仍很难煎煮出来。从药效实验结果来看,酸枣仁粉碎组与酸枣仁未粉碎组均能延长戊巴比妥钠的睡眠时间,但酸枣仁未粉碎组只是有延长睡眠时间的趋势,而酸枣仁粉碎组有较好的延长睡眠的作用,与对照组比较差异有统计学意义。本研究从化学成分和药效作用两方面证实,粉碎与未粉碎的酸枣仁在水煎煮过程中其有效成分的溶出和安神药效作用均有一定的差异。因此,临床酸枣仁的应用还是宜粉碎。

    在小鼠自主活动影响的实验中,给药后30 min,安定组自主活动与对照组比较差异有统计学意义,酸枣仁粉碎组和未粉碎组与对照组比较,虽然均能减少自主活动数量,但无统计学意义。这说明酸枣仁镇静作用较弱,其安神功效可能还与别的作用有关,这也符合中药多成分、多途径、多靶点的作用特点。

    为了考察试验所用酸枣仁中酸枣仁皂苷A的绝对含量,同时考察水提取过程中酸枣仁皂苷A的转移率,故制备了样品Ⅲ。样品Ⅰ和样品Ⅲ相比较,前者的含量远低于后者。一方面是粉碎的粒度不同,样品Ⅲ所用的酸枣仁是过40目筛,样品Ⅰ所用的酸枣仁是过12目筛。另一方面是提取溶媒不同,酸枣仁皂苷A属于达玛烷型四环三萜皂苷类化合物,皂苷元不溶于水,能溶于有机溶剂[3]。通过分析酸枣仁皂苷A的化学结构可知,由于糖分子的引入,使酸枣仁皂苷A极性增大,可溶于水,但由于结构中内酯环和分子内氢键的作用,酸枣仁皂苷A极性仍然较弱,从而使酸枣仁皂苷A更易溶于甲醇等溶剂中。论文发表网

    在含量测定的试验过程中,曾选择乙腈-水系统作为流动相,但溶剂峰的干扰相对较大,不如用甲醇-水系统的效果好。