降钙素基因相关肽对HaCaT细胞增殖和凋亡的影响

【摘要】  　　目的 探讨降钙素基因相关肽（CGRP）对HaCaT 细胞增殖、凋亡的影响。方法 以不同浓度(10-7 ～10-4 mmol/L)CGRP作用于HaCaT 细胞，用MTT法检测其对细胞吸光度（A）及生长曲线的影响；流式细胞术分析其对细胞凋亡率的影响。结果 不同浓度CGRP组A值均较对照组升高（F=7.78，q=3.53～7.71，P<0.05）。CGRP浓度在10-7 ～10-5 mmol/L时HaCaT 细胞吸光度随浓度增加而升高,但差异无统计学意义（P>0.05），在10-4 mmol/L时A值较10-5 mmol/L时反而降低（q=4.18，P<0.05）。细胞凋亡率随CGRP浓度升高下降，与对照组比较，差异有显著性（χ2=85.75～374.24，P<0.01)。结论 CGRP可以促进HaCaT 细胞增殖，抑制其凋亡,且作用强度与浓度有关。 
【关键词】  降钙素基因相关肽 HaCaT 细胞 银屑病 细胞凋亡 医学职称论文发表 医学论文发表网 医药论文发表 医学论文发表网站 医学论文发表期刊
　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of calcitonin gene?related peptide (CGRP) on the proliferation and apoptosis of HaCaT cells. Methods Absorbance (A) of HaCaT cell treated with CGRP in different doses (range:10-7-10-4 mmol/L) and cell growth curve was determined by MTT. Apoptosis rate was assessed with flow cytometry.  Results Absorbance of HaCaT cell treated with CGRP increased significantly, compared with that of the control (F=7.78,q=3.53-7.71,P<0.05). The apoptosis rate of HaCaT cells treated with CGRP was significantly lower than that of the control (χ2=85.75-374.24,P<0.01). Conclusion CGRP can promote HaCaT cell proliferation and inhibit apoptosis effectively. The effect is related to the concentration of CGRP.
    
　　［KEY WORDS］ Calcitonin gene?related peptide; HaCaT  cells;  Psoriasis; Apoptosis
    
　　HaCaT细胞株是发生了自身转化的人类角质形成细胞永生细胞株，许多生物学特性都与正常人角质形成细胞相似。本文采用不同浓度的降钙素基因相关肽（CGRP）作用于HaCaT细胞,观察其对HaCaT 细胞增殖和凋亡的影响，推测其在机体内可能引起的变化，以探讨其在银屑病皮损形成过程中的作用。
　　1  材料和方法
　　1.1  材料
　　1.1.1  HaCaT细胞  由青岛大学医学院药理学教研室王春波教授馈赠。
　　1.1.2  主要试剂  CGRP及角质形成细胞无血清培养基（KC?SFM）、DMEM培养基、四甲基偶氮唑蓝（MTT）（Sigma公司），Annexin?V凋亡试剂盒（深圳晶美公司），碘化丙啶、胰蛋白酶（北京中昊时代生物科技公司），乙二胺四乙酸钠（EDTA，上海生工生物工程公司），二甲基亚砜（DMSO，天津市天河化学试剂厂）。
　　1.1.3  主要仪器、设备  酶联免疫检测仪 (Bio?Rad Modal 550 USA)，流式细胞仪(Becton Dickinson USA)，LXJ?Ⅱ型离心机（南京第一医疗器械厂），倒置显微镜(Olympus)，CO2孵育箱(Memmert USA)。
　　1.2  方法
　　1.2.1  实验分组  用KC?SFM配制成CGRP浓度分别为10-7 、10-6、10-5、10-4  mmol/L的实验组和不加CGRP的对照组。
　　1.2.2  CGRP对细胞增殖和生长曲线影响的检测采用MTT法检测。将HaCaT细胞以每孔4×103的密度接种至96孔板，CO2培养箱内培养24 h后，吸弃培养液，各孔分别加入上述不同浓度的培养液200 μL,并设空白对照组。每天每组取3孔加入MTT溶液20 μL（5 g/L），继续培养4 h，小心吸去孔内上清液，加入DMSO，振荡10 min，在酶联免疫检测仪上测定各孔490 nm处的吸光度值（A），连续测定5 d。取第48小时吸光度值计算增殖率。并以时间为横轴，吸光度值为纵轴，绘制生长曲线。
　　1.2.3  细胞凋亡检测  将HaCaT细胞以每孔2×105的密度接种于6孔板培养24 h后，吸弃培养液，PBS冲洗3次，分别加入上述各浓度的培养液,继续培养48 h后，严格按照Annexin?V试剂盒说明书处理细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡。
　　1.3  统计学处理 
    
　　结果以±s表示，数据间比较采用方差分析及χ2检验，应用SPSS 13.0软件进行数据处理。
　　2  结果
　　2.1  CGRP对HaCaT细胞增殖和生长曲线影响
　　2.1.1  CGRP对HaCaT细胞增殖影响  各实验组吸光度（A）均较对照组上升，差异有显著性（F=7.78，q=3.53～7.71，P<0.05）。浓度在10-7  ～10-5 mmol/L之间时A值随CGRP浓度增加而升高，但各组间差异无统计学意义（P>0.05）；CGRP浓度为10-4 mmol/L时A值虽仍比对照组高，但较10-5 mmol/L时明显降低（q=4.18，P<0.05），与其他剂量实验组相比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
　　表1  CGRP对HaCaT细胞增殖的影响（略）
　　与对照组比较，F=7.78，*q=3.53～7.71，P<0.05
　　2.1.2  CGRP对HaCaT细胞生长曲线的影响由于10-4 mmol/L组浓度升高，但促增殖作用却减弱，故取10-4 mmol/L组及促进增殖能力最强的10-5 mmol/L组做生长曲线。与对照组比较，在CGRP作用下HaCaT细胞提前进入对数生长期。在对数生长期（第2、3天），10-5 mmol/L组细胞数最多；10-4 mmol/L组与对照组相比细胞数增多，但较10-5 mmol/L组减少。到达平台期后，3组细胞数又相接近。
　　2.2  CGRP对HaCaT细胞凋亡的影响
    
　　作用48 h后，对照组凋亡率为7.93%，10-7～10-4 mmol/L组细胞凋亡率分别为4.74%、3.73%、2.81%、1.99%，各实验组与对照组比较，差异有统计学意义（χ2=85.75～374.24，P<0.01）。
　　3  讨论
    
　　CGRP是一种含37个氨基酸的神经肽，在皮肤中主要存在于真皮、表皮交界处，是人体皮肤中含量最丰富的一种神经肽。CGRP自身或通过与体内多种神经肽和细胞因子如神经生长因子（NGF）[1]、血管内皮细胞生长因子(VEGF)[2]等，导致毛细血管扩张，角质形成细胞过度增殖，并趋化炎症细胞，引起炎症反应，从而参与银屑病皮损的形成。

本实验应用MTT法和流式细胞术检测不同浓度CGRP对HaCaT细胞增殖和凋亡的影响，结果显示，CGRP可以促进HaCaT细胞增殖并抑制其凋亡。CGRP抑制细胞凋亡的作用呈现浓度依赖性，在CGRP浓度10-7 ～ 10-4 mmol/L之间时，其促进增殖作用随浓度升高而增强；但当CGRP浓度升高至10-4 mmol/L时其促增殖作用反而减弱。
    
　　以往国内外诸多研究结果均显示，银屑病皮损中CGRP含量增加［3］，因此，推测在银屑病皮损中异常增高的CGRP可能促进角质形成细胞增殖并抑制其凋亡，导致皮损中角质形成细胞数量增多，从而参与角化过度性皮损的形成。有实验表明，UVB照射可诱导HaCaT细胞凋亡[6]。另外，值得注意的是，LEGERT等[7]报道，用UVB照射无毛小鼠后其皮肤中CGRP含量增高，局部皮肤免疫反应呈抑制状态。大量临床及实验研究均证实，UVB照射可减轻银屑病皮损的炎症反应，改善角化异常，是治疗银屑病的有效方法。故结合本实验推测，UVB照射后，角质形成细胞凋亡增多，且银屑病皮损中原本已增高的CGRP含量进一步升高，当超过某一界限值，其促进角质形成细胞增殖作用减弱，导致角质形成细胞数量减少，同时CGRP与体内其他神经肽和细胞因子相互调节，参与局部免疫抑制，从而对银屑病皮损恢复发挥积极作用。
    
　　综上所述，CGRP对角质形成细胞的生长可能具有双向调节作用：在某一低浓度范围内CGRP可促进角质形成细胞增殖并抑制其凋亡，参与银屑病皮损的形成；如CGRP浓度升高超出一定范围，其促进角质形成细胞增殖的作用则减弱，参与银屑病皮损的恢复过程。本实验为体外研究结果，而角质形成细胞的生长增殖受体内多种因素的影响；另外，CGRP的浓度进一步提高（超过10-4 mmol/L）后角质形成细胞增殖与凋亡的变化还有待于探讨。
【参考文献】
  　　[1]ATTILA D, MóRIA K, HILDA, et al. Effect of the neuropeptides substance P, calcitonin gene?related peptide, vasoactive intestinal polypeptide and galanin on the production of nerve growth factor and inflammatory cytokines in cultured human keratinocytes[J]. Neuropeptides, 2006,40(4):251?263.
　　[2]YU X J, LI C Y, WANG K J, et al. Calcitonin gene?related peptide regulates the expression of vascular endothelial growth factor in human HaCaT keratinocytes by activation of ERK1/2 MAPK[J]. Regulatory Peptides, 2006,137(3):134?139.

　　[3]CHAN J, SMOLLER B R, RAYCHAUDHURI S P, et al. Intraepidermal nerve fiber expression of calcitonin gene?related peptide, vasoactive intestinal peptide and substance P in psoriasis[J]. Arch Dermatol Res, 1997,289(11):611?616.

　　[4]JIANG W Y, RAYCHAUDHURI S P, FARBER E M. Double?labeled immunofluorescence study of cutaneous nerves in psoriasis[J]. Int J Dermatol, 1998,37(8):572?574.

　　[5]HE Y, DING G, WANG X, et al. Calcitonin gene?related peptide in Langerhans cells in psoriatic plaque lesions[J]. Chin Med J, 2000,113(8):747?751.

　　[6]郭坤,纪凤芝,陶桂兰,等. UVB对HaCaT细胞凋亡的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2003,39(3)：299?303.

　　[7]LEGERT F J, JAIANI LT, WOLF P, et al. The role of calcitonin gene?related peptide in cutaneous immunosuppression induced by repeated subinflammatory ultraviolet irradiation exposure[J]. Exp Dermatol, 2004,13(4):242?250.