蛇菰内生菌的抑菌作用及活性有效成分分析

筒鞘蛇菰Balanophora involucrata Hook. f. 又名鹿仙草,为蛇菰科蛇菰属草本寄生植物，是我国传统道地中药材，具有凉血止血、清热解毒的功能，主治肺热咳嗽、吐血、肠风下血、风热癍疹、腰痛、疔疮肿毒等，民间也用于治疗肝炎、肿瘤等疾病，为传统民族用药, 我国有丰富的资源。分离的蛇菰内生菌并对其代谢产物进行研究，以期从微生物角度寻找其活性化合物，为研制新药开辟新的思路。本课题以分布于神农架地区的思茅蛇菰为研究对象进行其内生真菌的活性成分分离纯化筛选，并对蛇菰内生菌的代谢产物进行抑菌研究，以期寻找有效活性化合物。

　　1材料

　　1.1供试植物及菌株筒鞘蛇菰Balanophora involucrata Hook. f.，采自湖北省神农架。

　　1.2抑菌指示菌株金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)。

　　2方法

       从蛇菰中分离出49株内生真菌经纯化扩大后，经发酵培养，得到发酵液。取发酵浓缩液对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌进行抑菌测试。筛选出最佳抑制细菌的内生真菌，对相应菌株扩大摇瓶培养，用醋酸乙酯和正丁醇对此菌株发酵液进行萃取，分别用醋酸乙酯相、正丁醇相和水相浸膏对以上4种细菌进行抑菌测试，筛选出有效抑菌活性物质存在于何相中，并对有效抑菌活性物质作简要分析。

　　2.1发酵培养基PDA培养基：土豆200 g，蔗糖20 g，水1 000 ml，pH自然。

　　2.2发酵浓缩液的制备将菌种接于摇瓶后于28℃，100~110 r/min的摇床中培养5~9 d，待发酵液清澈并有大量菌落生长后取出。加入1~2 ml甲醇，用电动搅拌器在适当转速下对发酵液进行搅拌破碎。用32层纱布过滤，于 45℃下浓缩至50 ml左右。然后在5 000 r/min离心机中离心20 min，取上清液，冰箱保存备用。

　　2.3发酵浓缩液的抑菌实验采用牛津杯法。用混菌法或涂布法在每平皿加0.1 ml菌悬液，室温，吸附1 h，然后在上面均匀放置4个直径为6 mm的无菌不锈钢牛津杯。其内加离心发酵浓缩液200 μl;于37℃恒温培养12 h后，观察并记录抑菌圈的有无及其直径大小(每平皿4个牛津杯对称2种浓缩液，求直径的平均值)。筛选出最佳抑菌内生菌株。

　　2.4发酵液经乙酸乙酯、正丁醇后的抑菌实验对最佳抑菌内生菌株扩大培养，其发酵液用乙酸乙酯、正丁醇萃取浓缩后，将乙酸乙酯相、正丁醇相、水相浸膏于真空干燥葙干燥，然后配成浓度为10-2，10-3，10-4 g/ml和10-5g/ml样液。依据牛津杯法进行抑菌试验，两个抑菌圈直径的平均值即为最小抑菌浓度(MIC)。

　　2.5抑菌活性化合物薄层色谱分离将溶于三氯甲烷中的样品在硅胶薄板上点板后于层析缸内垂直展开，展开剂为氯仿和甲醇的配比液。然后用5%的磷钼酸溶液进行显色。

　　2.6化学鉴定反应

　　2.6.1盐酸-镁粉反应[1]鉴定黄酮类。将样品溶于1.0 ml甲醇或乙醇中，加入少量镁粉振摇，滴加几滴浓盐酸，1~2 min内(必要时微热)即可显色。多数黄酮、黄酮醇、二氢黄酮及其醇类化合物显橙红至紫红色。  国家级教育论文发表

　　2.6.2salkowski 反应[2]鉴定甾体皂苷类。 将样品溶于三氯甲烷中，加入适量浓硫酸，分层后，上层三氯甲烷显血红色或青色。下层浓硫酸显绿色荧光。

3结果

　　3.1筒鞘蛇菰内生菌发酵浓缩液对细菌的体外抑菌作用以牛津杯法对4种细菌做抑菌实验。实验结果见表1，共有20种发酵液对细菌有抑菌作用。其中SG003在发酵过程中颜色发生变红，根据颜色由红至淡黄色变化分别命名为SG003A，SG003B，SG003C，SG003D。表1筒鞘蛇菰内生菌发酵浓缩液对细菌的抑菌效果“-” 代表无抑菌圈;“+” 代表抑菌圈为1.000~1.500 cm范围内;“++” 代表抑菌圈为1.500~2.000 cm范围内;“+++” 代表抑菌圈为2.000~2.500 cm范围内;“*” 指在12 h后生长不明显，其抑菌效果为24 h所做记录

　　3.2筒鞘蛇菰内生菌发酵浓缩液萃取物对4种细菌的抑菌作用由表1看出SG047抑菌作用最佳，其扩大培养的发酵液用乙酸乙酯、正丁醇萃取浓缩后，将乙酸乙酯相、正丁醇相、水相浸膏，定量测量对细菌的最小抑菌浓度(MIC)。得到乙酸乙酯相对4种细菌有明显抑菌作用，而正丁醇相、水相无抑菌现象。乙酸乙酯相抑菌结果见表2。表2显示，乙酸乙酯相浸膏对大肠杆菌的MIC为10-5g/ml，对绿脓杆菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC均为10-4g/ml。

　　3.3筒鞘蛇菰内生菌SG047萃取后乙酸乙酯萃取相浸膏抑菌实验照片将乙酸乙酯萃取相浸膏稀释成10-2，10-3，10-4，10-5(g/ml)，空白组采用等体积纯乙酸乙酯。图1为筒鞘蛇菰SG047乙酸乙酯萃取相浸膏对细菌抑菌实验照片，其中左图为对大肠杆菌的抑菌作用，右图为枯草芽孢杆菌的抑菌作用。表2筒鞘蛇菰内生菌SG047萃取后其乙酸乙酯相抑菌试验及最小抑菌浓度图1筒鞘蛇菰内生菌SG047乙酸乙酯萃取浸膏对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用

　　3.4薄层色谱对乙酸乙酯相进行薄层色谱检测，展开剂三氯甲烷∶甲醇按照90：13进行展开时。效果最佳。硅胶薄板上有4个点，即至少有4中成分。依次从下到上，通过测量得出4个点的Rf值非别为：0.167，0.433，0.617，0.783。

　　3.5化学鉴定反应图2为盐酸-镁粉反应和salkowski 反应。通过观察颜色可以推出乙酸乙酯相中含有黄酮、黄酮醇、二羟黄酮及其醇类化合物和甾体皂苷类物质。图2筒鞘蛇菰内生菌SG047萃取后其乙酸乙酯萃取相浸膏化学鉴定反应  国家级教育论文发表

　　4结果

　　对49种内生菌发酵产物的抑菌实验可以得出，18株内生真菌发酵产物对细菌有一定的抑菌作用。其中SG047对4种细菌均有较强的抑菌效果。SG047扩大培养的发酵液经萃取后的抑菌试验可以看到，其有效抑菌活性物质在醋酸乙酯相中。其中醋酸乙酯相浸膏对大肠杆菌的MIC为10-5g/ml，对绿脓杆菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC均为104 g/ml。通过盐酸-镁粉反应和salkowski 反应。得出蛇菰内生菌SG047菌株发酵液的醋酸乙酯相中含有黄酮、黄酮醇或二羟黄酮及其醇类化合物和甾体皂苷类物质。

【参考文献】
  　[1]刘斌，石任兵，周素蓉. 苦参汤有效部位总黄酮含量测定方法研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2004，10(6)：24.

　　[2]吴立军. 中药化学[M].北京：中国医药科技出版社，2006：167.