大黄总蒽醌乙醇提取工艺优化实验

　大黄为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根及根茎，为临床常用中药，药用历史悠久，功效独特，张景岳将它与附子列为“乱世之良将”与“治世之良相”，同人参、熟地共称“药中之四维”，认为“病而至于可畏，势非庸庸所济者，非此四物不可”[1]。大黄中的有效成分有蒽醌类、芪类、苯丁酮类、鞣质类、色原酮类、萘类、有机酸、糖、蛋白质、甾醇等一百五十多种成分[2]，其中起主要作用的为蒽醌类成分。有关大黄总蒽醌的提取方法的报道甚多，传统多为水提法。赵文萍[3]等报道了正交试验法优选大黄提取工艺，均表明大黄渗漉法明显优于水提法，但渗漉法耗时长，不利于工作效率的提高。黄园等[4]通过正交试验法探讨了水提和醇提对大黄蒽醌提取率的影响，认为醇提对大黄蒽醌类成分的提取效果要优于水提，以80%乙醇为优，且煎煮时间均不宜过长，控制在1 h左右为宜。本实验同时运用单因素试验法及正交试验法优化大黄总蒽醌醇提工艺。以总蒽醌含量为考察指标，以紫外分光光度法为测量手段，先通过单因素考察出适合大黄蒽醌类成分提取的温度、粒度及乙醇浓度，再通过正交试验设计优化乙醇提取大黄总蒽醌工艺，从而为日后的蒽醌类成分分离纯化奠定基础。   医学类论文发表

　　1材料

　　1.1仪器与试剂Spectronic GENESYSTM2紫外分光光度计(美国);SHIMADZU CORPORATION AEG-220万分之一电子分析天平(日本导津);Sartorius BP211D十万分之一天平(瑞士);CQ-200超声清洗仪(上海音波声电科技公司);HH恒温水浴锅(江苏金坛市中大仪器厂)。所用试剂分析纯来自天津市富宇精细化工有限公司;所用水为双蒸水。

　　1.2药材与对照品大黄由广州致信中药饮片有限公司提供，经鉴定为四川产药用大黄R. officinale Baill.的干燥根茎。 1,8-二羟基蒽醌对照品(0829-9702)由中国药品生物制品检定所提供;所用试剂分析纯来自天津市富宇精细化工有限公司;所用水为双蒸水。

　　2方法  医学类论文发表

　　2.1干膏的制备 取大黄提取液，置水浴上蒸干，于烘箱60～80℃烘至恒重，取出，置干燥器中冷却，即得。

　　2.2含量测定

　　2.2.1供试品溶液的制备 取大黄干膏适量(相当于生药0.5 g)，精密称定，置具塞锥形瓶中，加水25 ml超声提取5 min使溶解，加入乙醚30 ml，超声提取25 min，置分液漏斗中，分取乙醚层，备用。水层加入2.5 mol·L-1H2SO4 30 ml超声提取5 min，加入乙醚30 ml水浴回流提取1 h，放冷，置分液漏斗中，分取乙醚层，酸液再用乙醚洗涤3次，每次20 ml，合并乙醚液，蒸馏水洗至中性，与水解前乙醚液合并，回收乙醚至干，残渣加0.5%Mg(Ac)2甲醇使溶解，转移至50 ml量瓶中，加0.5%Mg(Ac)2甲醇至刻度，摇匀。精密移取上述溶液2.0 ml，置25 ml容量瓶中,加 0.5%Mg(Ac)2甲醇至刻度作为供试品溶液，即得。

　　2.2.2标准溶液的制备 精密称取P2O5干燥至恒重的1,8-二羟基蒽醌对照品适量加乙醚制成每毫升含0.20 mg的溶液，即得。

　　2.2.3标准曲线制备及线性范围考察精密量取上述标准溶液0.20，0.40，…2.00 ml，分别置于25 ml量瓶中，挥干乙醚，残渣用0.5%Mg(Ac)2甲醇溶液使溶解，加至刻度，摇匀。以0.5%Mg(Ac)2甲醇溶液为空白对照，于520 nm波长处测定其吸光度，得回归方程：Y=42.067X+0.013 9，r=0.999 4，线性范围1.61～16.1 μg/ml。

　　2.2.4颜色稳定性实验 取“2.2.3”项下3号试样，依一定时间间隔下测定吸光度。其结果见表1。表1颜色稳定性实验结果
2.3单因素考察

　　2.3.1提取温度考察取大黄粉末(过1号筛)约5 g，精密称定，加入60%乙醇50 ml，于水浴50，60，70，80，100℃及恒温电热套110℃下加热回流1 h，滤过，滤液制成干膏，称定重量，按“2.2.1”项制备供试品溶液，UV法测定总蒽醌。结果见图1。当温度达到100℃时，大黄总蒽醌的溶出最大。图1提取温度考察

　　2.3.2大黄粉末粒度考察各取10，20，60，80，100，200 目的大黄粉末约5 g，精密称定，加60%乙醇50 ml，水浴加热回流1 h，滤过，滤液制成干膏，称定重量，按“2.2.1”项制备供试品溶液，UV法测定总蒽醌。结果见图2。图2大黄粉末粒度考察当粉末粒度达到60目可以增加大黄总蒽醌的溶出，10目次之。

　　2.3.3乙醇浓度考察取大黄粉末(过1号筛)约5 g，精密称定，加入10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%乙醇各50 ml，回流提取1 h，滤过，滤液制成干膏，称定重量，按“2.2.1”项制备供试品溶液，UV法测定总蒽醌。结果见图3。大黄总蒽醌在70%乙醇中溶出最大，50%、60%、80% 3个乙醇浓度下总蒽醌的溶出无显著差别，因此取50%、60%、70%作为正交实验醇浓度因素的3个水平。　　图3乙醇浓度考察

　　2.4正交实验设计

　　2.4.1因素水平确定根据上述单因素考察结果，取大黄药材约5 g，精密称定，于100℃水浴回流提取条件下，选取乙醇浓度(A)、回流时间(B)、浸泡时间(C)、乙醇用量(D)4因素，每个因素选择3个水平设计乙醇提取工艺。结果见表2。表2大黄乙醇提取工艺因素水平表L9

　　2.4.2正交实验设计及结果按表2进行试验，每个试验号平行2份，每份提取按表2提取3次。按“2.1”项下制备供试品，520 nm测定个试验号总蒽醌含量。正交实验及结果见表3，方差分析见表4。表3大黄乙醇提取工艺实验与结果表4大黄总蒽醌方差分析

　　2.4.3正交实验结果由3～4可知，影响大黄蒽醌类成分提取的最大因素为乙醇浓度，其影响因素主次关系为乙醇浓度> 回流时间>加醇量>浸泡时间，其最佳醇提工艺是A3B2C1D2。

　　2.5提取次数考察 取大黄药材约5 g，分别于最佳醇提工艺下提取2，3，4，5次，比较提取次数对大黄总蒽醌溶出的影响。结果见表5。表5提取次数的比较

　　3讨论医学类论文发表

　　综合上述各项分析结果表明，大黄总蒽醌提取的最佳工艺为：过10目筛大黄粉末以70%乙醇12倍药量，无浸泡，于100℃回流提取0.5 h，提取3次。根据实验结果分析，大黄蒽醌成分随提取时间及提取温度的变化而变化，主要是因为大黄的煎熬过程愈长泻下作用愈弱，大黄汤液的各种蒽醌的含量随煎煮时间的不同而不同。因此在正交实验设计中，因素B选择了0.5，1，2 h作为其3个水平。粒度方面，由图2可知同等条件下，提取60目大黄粉末所得蒽醌成分最高，10目次之，但60目提取后滤过过程中沉淀析出较多不利于过滤，故选择10目大黄粉末。当温度达到100℃时大黄蒽醌类成分溶出增加，但苏子仁等[5]认为，由于加热可发生醌类递氢自催化的自由基型氧化还原反应，在此温度下提取大黄是否会对其疗效产生影响还有待进一步探究。