参力保对家兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用

 作者：董淑雯 宋海滨 单迅 金毅

【摘要】  　　目的 观察参力保对家兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用。方法 医学职称论文发表 医学论文发表网 医药论文发表 医学论文发表网站 医学论文发表期刊 结扎兔冠状动脉左前降支（LAD）30 min，再灌注120 min后制备家兔心肌缺血再灌注模型。56只家兔，随机分为7组，生理盐水对照组：假手术组，模型组（给予溶媒8.58 mg/kg），参力保高剂量组（22.36 mg/kg，内含5.2 mg/kg人参皂苷Rg2），参力保中剂量组（11.18 mg/kg，内含2.6 mg/kg人参皂苷Rg2），参力保低剂量组（5.59 mg/kg，内含1.3 mg/kg人参皂苷Rg2），阳性对照组（给予盐酸尼卡地平注射液），测定血浆磷酸激酸同工酶（CK?MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、天门冬氨酸转氨酶(AST)和心肌组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）及游离脂肪酸 (NFFA) 含量；高效液相法测定心肌组织去甲肾上腺素（NE）含量。结果 参力保能显著降低血浆CK?MB和LDH、AST的活性，与模型组相比有显著差异（F=13.031～32.604,P<0.05、0.01）。参力保3个剂量组与模型组比较可明显降低心肌MDA含量，提高SOD活性和NE的含量（F=2.880～15.927，q=5.249～12.510,P<0.05）；参力保高、中、低剂量组NFFA与模型组比较，差异有显著性（Z1=Z2=Z3=-2.329，P<0.05）。结论 参力保对家兔心肌缺血再灌注损伤有保护作用，其机制与清除自由基抑制脂质过氧化反应有关。 
【关键词】  参力保 再灌注损伤 心肌 脂质过氧化损伤 兔
　　［ABSTRACT］ Objective To investigate the effect of Shenlibao against myocardial ischemia reperfusion injury in rabbits.Methods An animal model was established by ligation of left desending coronary artery for 30 min and reperfusion for 120 min. Fifty?six rabbbits were randomly divided into seven groups: saline control group, sham?operation group, media control group, high?dose Shenlibao group, moderate?dose Shenlibao group, low?dose Shenlibao group and nicardipine hydrochloride treatment group. Serum level of CK?MB and lactate dehydrogenase (LDH), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) and free fatty acids (NFFA) were detected. Results Compared with the control groups, Shenlibao decreased the activity of CK?MB and LDH in blood plasma (F=13.031-32.604;P<0.05,0.01). Furthermore, Shenlibao of three different?dosage groups increased the activity of superoxide dismutase (SOD) (F=8.765,P<0.01), reduced malondialdehyde (MDA) (F=2.880,P<0.05) and free fatty acids (NFFA) content in myocardium (Z1=Z2=Z3=-2.329,P<0.01), and raised myocardial norepinephrine (NE) contents (F=15.927,P<0.01). Conclusion Shenlibao has a protective effect on myocardial ischemia reperfusion injury. The mechanism is related to the clearance of free radicals and inhibition of subsequent lipid peroxidation.
    
　　［KEY WORDS］ Shenlibao; Reperfusion injury; Myocardium; Lipid peroxidation damage; Rabbit
    
　　研究表明，氧自由基及其脂质过氧化反应是导致心肌缺血再灌注损伤的重要因素之一[1]。人参总皂甙对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[2]。参力保的有效成分系从五加科植物人参属人参Panax ginseng茎叶中提取的单体人参皂苷Rg2的羟丙基?β?环糊精包裹物，其对心肌缺血再灌注损伤的作用报道较少。本实验以兔复制心肌缺血再灌注模型为研究对象，观察参力保对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，为其临床应用提供理论依据。
　　1  材料和方法
　　1.1  实验材料
　　1.1.1  动物  普通级大耳白兔，体质量为2.0～3.0 kg，由武汉市新洲区全耀动物养殖场提供（实验动物合格证号：Scxk(鄂)2004?0006）。
　　1.1.2  药品及试剂  参力保粉剂由吉林省中医中药研究院提供，临用时配成所需浓度；羟丙基?β?环糊精由西安德立生物化工有限公司生产；盐酸尼卡地平注射液由日本山之内制药株式会社生产，批号041117A；丙二醛（MDA）测试盒，批号20060313；过氧化物歧化酶（SOD）测试盒，批号20060317；游离脂肪酸（NFFA）测试盒，批号20060321，均由南京建成生物工程研究所提供。乳酸脱氢酶（LDH）测试盒,批号：200507130031；肌酸磷酸激酶（CK?MB）测试盒, 批号：200511050051；天冬氨酸转氨酶（AST）测试盒，批号：200511050101；总蛋白（TP）试剂盒，批号200507260031，均由中生北控生物科技股份有限公司提供。盐酸去甲肾上腺素(NE)、辛烷基硫酸钠购自Sigma公司。
　　1.1.3  仪器  全自动生化分析仪（LANDMARK,AG?Ⅱ,美国）。高效液相色谱仪(600 HPLC泵，717自动进样器，2465电化学检测器，Empower色谱管理软件,美国Waters公司)。
　　1.2  实验方法
　　1.2.1  模型制备  大耳白兔56只，用20 g/L戊巴比妥钠30 mg/kg经耳缘静脉缓慢注入，麻醉后固定于兔台，去胸前毛，沿胸正中线剪开皮肤，从剑突上沿胸骨正中线开胸，以小型开胸器扩开切口使心脏暴露良好，按文献[3]介绍方法进行缺血再灌注实验。实验分7组。正常对照组：麻醉后，至实验结束时，开胸从左心室取血和左心室肌；假手术组：开胸LAD下穿线不结扎,给予生理盐水；模型组：给予溶媒（羟丙基?β?环糊精）8.58 mg/kg；参力保用药组：高剂量组（22.36 mg/kg，内含人参皂苷5.2 mg/kg），中剂量组（11.18 mg/kg，内含人参皂苷2.6 mg/kg），低剂量组（5.59 mg/kg，内含人参皂苷1.3 mg/kg）；阳性对照组：给予盐酸尼卡地平注射液（0.25 mg/kg）。用药体积均为2 mL/kg体质量。
　　1.2.2  不同浓度NE标准品的配制  精确称取NE标准品1 mg，加入0.1 mol/L HClO4 1 mL,浓度为1 g/L,为标准储备液。取标准储备液各10 μL,加流动相990 μL稀释，浓度为10 mg/L,为标准应用液。用前取标准应用液各40 μL，将流动相稀释至1 000 mL,浓度为400 μg/L,将该液依次稀释，得到一系列不同浓度的标准液，浓度分别为400、200、100、50、25 μg/L。
　　1.2.3  流动相组成  0.1 mol/L柠檬酸?0.1 mol/L醋酸钠溶液(pH 3.7,内含有体积分数为0.10的甲醇，1.2 mmol/L辛烷基硫酸钠，1.3 mmol/L 二正丁酰胺)，真空抽滤脱气后使用，流量1.2 mL/min,电化学检测器工作电压+0.75 V。
　　1.3  测定项目
　　1.3.1  血浆心肌酶测定  心脏采血（肝素抗凝），3 000 r/mim离心15 min，取上清，用自动生化分析仪测定血浆CK?MB、LDH、AST的活性。
　　1.3.2  心肌组织中SOD活性、MDA及NFFA活性测定  取血后迅速剪取心脏，沿冠状沟剪开取左心室肌，用4 ℃生理盐水冲净血迹后，加入0.1 mol/L PBS冰浴制成100 g/L的心肌组织匀浆，3 000 r/min离心15 min，取上清液按试剂盒要求测MDA、NEFA含量及SOD活性，并测定心肌组织匀浆TP含量。
　　1.3.3  心肌组织NE含量测定  用高效液相色谱?电化学检测法(HPLC?EC)进行检测。操作方法如下：取左心室肌组织100～120 mg，加入350 μL4 ℃的0.4 mol/L高氯酸溶液（含0.5 mol/L EDTA，0.1 g/L半胱氨酸） 冰浴中制成心肌组织匀浆，离心（4 ℃，1 0000 r/min，10 min），取上清液与1/2体积的钾盐溶液（含枸橼酸钾20 mmol/L，K2HPO4 300 mmol/L，EDTA 2 mmol/L）混合，冰浴静置10 min，离心（同前），上清液20 μL注入色谱系统分析,比较组织样品中NE含量。
　　2  结果
　　2.1  参力保对血浆心肌酶的影响
    
　　参力保3个用药组、阳性对照组与模型组比较，均可明显降低CK?MB、LDH和AST的活性（F=13.031～32.604，q=4.573～17.501,P<0.05）；参力保3个剂量组与正常对照组及阳性对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
　　表1  参力保对缺血?再灌注损伤后血浆心肌酶活性的影响（略）
　　与模型组比较，F=13.031～32.604，#q=4.573～17.501，P<0.05
　　2.2  参力保对心肌组织MDA含量、SOD活性及NFFA含量的影响
    
　　参力保3个剂量组与模型组比较可明显降低心肌MDA含量，提高SOD活性和NE的含量(F=2.880～15.927,q=5.249～12.510,P<0.05)；参  
2期董淑雯,宋海滨,单迅,等. 参力保对家兔心肌缺血再灌注损伤的保护作用101
力保高、中、低剂量组NFFA与模型组比较差异有显著性（Z1=Z2=Z3=-2.329,P<0.05)；参力保3个剂量组与正常对照组及阳性对照组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
    
　　表2  参力保对缺血?再灌注损伤后家兔心肌MDA、SOD、NFFA和NE的影响（略）
　　与模型组比较，F=2.880～15.927，#q=5.249～12.510,Z1=Z2=Z3=-2.329，P<0.05
　　3  讨论
    
　　自20世纪80年代以来，随着溶栓疗法、经皮穿刺冠状动脉腔内成形术（PTCA）、冠状动脉旁路移植术、激光冠状动脉再通术等在临床上的广泛应用，心肌缺血再灌注损伤越来越受到重视。1960年，JENNINGS首次提出了心肌再灌注损伤的概念，指出组织缺血缺氧性损伤不但发生于缺血当时，更主要发生于恢复血液灌注后，其机制到目前为止尚不十分明确，但主要涉及细胞低氧、能量代谢障碍和自由基产生及由此而引发的一系列复杂的细胞、组织、器官结构功能的病理变化过程[5]。大量研究资料表明，氧自由基（OFR）生成过多和（或）清除能力下降，在缺血再灌注损伤的机制中占重要地位，使用电子共振自旋技术直接测定或其他方法检测OFR，发现心肌缺血再灌注几秒至几分钟内血液和心肌组织内OFR呈爆发性产生[6]。自由基能使生物膜的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化，生成脂质过氧化物（LPO）。LPO分解时产生的丙二醛能使DNA、蛋白质发生交联造成细胞损伤，心肌缺血再灌注损伤时降低了线粒体Mn?SOD活性和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活性，使心肌防御过氧化的能力下降。因此，可将SOD活性和MDA含量作为自由基损伤的间接依据，而缺血后心肌酶释放则是反映心肌损害程度的重要指标。目前临床多以血清心肌酶活性升高，特别是CPK?MB升高作为心肌缺血或梗死的早期诊断指标。
　以往的研究结果表明，急性心肌缺血等心功能障碍时，往往伴有脂肪酸代谢障碍，心肌中NFFA聚集与心肌生物膜磷脂水解，并引起和加重心功能不全[7,8]， FFA在心肌内的聚集可抑制腺苷酸转移酶的活性，影响线粒体内大量ATP与线粒体外ADP的交换，导致氧化磷酸化脱耦联，能量不能有效的利用，心肌收缩受到限制[9]。同时高浓度的FFA对细胞膜有一定的皂化作用（saponification），造成细胞膜损伤，抑制Na+,K+?ATPase活性，导致细胞内K+外流丢失、抑制Ca2+?ATPase和Mg2+?ATPase活性[9]，使膜上“钙泵”丧失将Ca2+从胞内泵到胞外的作用，导致细胞内钙超载引起心律失常[10]。本实验结果表明，模型组血CK?MB、LDH、AST活性和心肌中MDA、NFFA含量均有显著增加，说明在心肌缺血再灌注时心肌损害严重，参力保可显著降低心肌中FFA含量，可能是心肌保护的作用机制之一。
    
　　参力保是具有药理活性的人参皂苷单体成分。本文结果表明，参力保组与模型组比较可明显降低CPK?MB、LDH、AST活性，降低心肌MDA、NFFA含量，而使SOD活性水平显著升高，说明参力保有抑制自由基产生，减少脂质过氧化反应，保护细胞膜完整，起到稳定溶酶体膜的作用，抑制了胞内酶的释放，从而改善心肌代谢，减轻心肌损伤。本实验利用HPLC?EC法检测心肌单胺类物质，显示参力保3个剂量组心肌NE的含量明显高于模型组，特别是高剂量组，由此亦证实参力保具有保护心肌细胞膜的完整性，使NE释放减少的作用。
    
　　综上所述，参力保可抑制兔心肌缺血再灌注时的自由基产生，提高SOD活性，减轻脂质过氧化反应，从而起到对心肌损伤的保护作用。
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