低氧诱导因子?1α在大鼠胶原诱导性关节炎中的表达及与血管生成的关系

类风湿关节炎(RA)是一种以慢性、对称性、多关节炎症为主要表现的自身免疫性疾病，其病因和发病机制迄今尚未明确。RA主要病理改变为滑膜炎，滑膜细胞的类肿瘤样增殖和大量炎症细胞的浸润，造成一个低氧微环境。低氧诱导因子?1α(HIF?1α)是介导细胞对缺氧微环境适应反应的关键性调控因子。研究发现，有核细胞缺氧时，均可引发HIF?1α的高表达〔1〕。新生血管形成是造成滑膜炎、血管翳、关节破坏发生发展的一个重要环节，血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最强有力促血管生成因子，直接参与新生血管形成。在RA中VEGF能够促进滑膜血管翳的形成、加重滑膜炎症及骨与关节软骨的破坏。本实验以大鼠Ⅱ型胶原诱导性关节炎(collagen Ⅱ?induced arthritis,CIA)为模型，研究HIF?1α在CIA中的表达及与新生血管生成之间的关系，初步探讨HIF?1α在RA发病过程中的作用及与VEGF之间的关系，有助于了解HIF?1α对于RA发生发展的调控作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物和试剂 雌雄各半健康SD大鼠50只(体重150～180 g)，动物级别：清洁级(SPF)，由本院动物中心提供，动物许可证号：SCXK桂2007?0001，购入本实验室适应性饲养1 w后进行实验。随机分为正常对照组，四个造模组，每组按照随机方式1～10进行编号。牛Ⅱ型胶原(美国Chondrex公司);不完全弗氏佐剂(IFA，美国Sigma公司);HIF?1α单克隆抗体(美国Chemicon公司);VEGF单克隆抗体(美国Santa Cruz公司);二抗试剂盒(福州迈新公司)。

　　1.2 动物模型及关节标本制作 按照文献提供的方法稍加修改建立Ⅱ型胶原诱导型关节炎大鼠模型〔2〕，牛Ⅱ型胶原和IFA按1∶1充分乳化成终浓度为1 g/L乳剂。分4～5点在大鼠尾根部、背部皮内注射0.5 ml，对照组注射同量生理盐水，7 d后同法半量加强免疫一次。四个造模组大鼠分别于初次免疫后第21天、第28天、第35天、第42天处死;对照组大鼠于注射生理盐水后第42天处死。处死后大鼠取踝关节，乙二胺二乙酸(EDTA)脱钙2～3 w后，石蜡包埋、切片，行HE染色，SP免疫组织化学法检测HIF?1α、VEGF蛋白的表达。

　　1.3 观察指标

　　1.3.1 大鼠一般状况及体重测定 造模前后动态观察大鼠体重、毛发色泽改变、神志、活动状态，食量变化及关节红肿情况，每周定期测量大鼠体重。

　　1.3.2 关节炎指数〔3〕(AI) 根据大鼠踝关节、跖趾关节、趾关节红肿程度及受影响关节数进行评分。0分：正常;1分：1个关节红肿;2分：2个及2个以上关节红肿;3分：踝关节以下足掌严重红肿;4分：包括踝关节在内的全部足爪红肿且不能负重。四肢分别进行评分，总和即为AI。AI>5分为造模成功。

　　1.3.3 踝关节影像学观察 初次免疫后第21天、第42天经1%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，行踝关节X线摄片。摄片条件为40 kV。

　　1.3.4 免疫组织化学染色结果判定及评分 采用半定量记分法判定：①按阳性着色程度评分。0分为无着色，与背景色一致;1分为浅黄色，略高于背景色;2分为棕黄色，明显高于背景色;3分为棕褐色。②按阳性细胞所占比例评分。0分为阴性;1分为10%以下;2分为11%～50%;3分为51%～75%;4分为75%以上。③两者乘积判定阳性结果。HIF?1α阳性细胞为胞浆或胞核呈棕黄色或棕褐色，VEGF阳性细胞为胞浆呈棕黄色或棕褐色。

　　1.4 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行处理，正态分布资料用x±s表示;多组间均数的比较采用单因素方差分析;半定量资料两组间比较采用Mann?Whitney秩和检验;对两组数据间的相关性进行Spearman等级相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 大鼠CIA模型的建立 模型组40只大鼠在首次给药后第12天起，有26只出现踝、跖趾关节以及趾关节红肿。对照组未出现明显关节红肿。造模成功率为65%(26/40)。

　　2.2 一般情况 造模期间动物无死亡,对照组大鼠体重逐渐增加、精神良好、活动自如。模型组给药12 d后开始出现不同程度后足爪红肿、皮温升高、脱毛、精神怠倦、体重增长减慢甚至下降、饮食饮水量下降。给药48 h后注射部位出现炎性小溃疡，红肿明显，逐渐加重并破溃，7～10 d破溃处形成硬痂，而后脱落溃疡愈合。
　2.3 CIA大鼠AI变化 随着炎症的发展，AI值逐渐增加。初次免疫12 d及以后各时间点AI值均与正常组(0.40±0.52)比较有差异(P<0.05)，第21天达峰值(10.63±1.06)，之后第28、35天(9.20±0.84，7.43±1.13)逐渐下降，第42天(6.33±1.03)降至最低值，但仍高于正常组(均P<0.05)。正常对照组AI值均小于1。

　　2.4 X线改变 对照组踝关节软组织无肿胀，骨质无破坏，足趾关节间隙清楚。模型组免疫后第21天，踝关节周围软组织肿胀，足趾关节间隙模糊、狭窄及融合等表现。第42天踝关节骨骼结构排列紊乱，关节间隙不清，可见囊性骨吸收和骨侵蚀。提示模型组发生慢性侵蚀性关节炎。见图1。

　　2.5 大鼠踝关节病理学变化 正常大鼠滑膜由1～2层扁平滑膜细胞组成，无炎细胞浸润及血管增生，关节结构完整，软骨层较厚，表面光滑。CIA组大鼠初次免疫后21 d时滑膜细胞层数增至10～15层，增生滑膜形成血管翳，炎细胞浸润;42 d侵蚀软骨及骨，关节软骨可见坏死脱落、纤维化，广泛炎细胞浸润，伴有不同程度的软组织水肿，滑膜下层大量纤维增生及新生血管形成，呈肿瘤性侵袭性生长。见图2。

　　2.6 CIA大鼠滑膜HIF?1α、VEGF蛋白的表达 正常对照组均未见HIF?1α、VEGF蛋白表达。CIA模型组HIF?1α、VEGF表达增强，HIF?1α在细胞核及细胞质中均表达，VEGF表达于细胞浆中。从免疫组化结果可以看出不仅滑膜细胞，滑膜下层巨噬细胞、部分血管内皮细胞、成纤维细胞等也表达HIF?1α、VEGF。HIF?1α表达与AI呈正相关(r=0.725，P<0.01)， HIF?1α与VEGF蛋白表达情况进行相关回归分析，呈明显正相关(r=0.75，P<0.01)。两者均在第21天、第28天滑膜细胞阳性表达量及程度最高，随病程进展，阳性表达量及程度逐渐下降。见图3，表2。图1 大鼠踝关节X线检查 图2 大鼠踝关节腔病理学变化 HE染色　图3 模型组关节滑膜组织HIF?1α和VEGF表达(DAB，×400)表2 各组大鼠滑膜HIF?1α、VEGF蛋白表达的免疫组化评分

　　3 讨 论

　　CIA是目前用于研究RA较为理想的动物模型，其免疫机制、关节病理改变、临床表现和实验室指标与人类RA接近，如滑膜增生、血管翳形成，以及随之出现的软骨及骨破坏、侵犯肢体远端关节及对胶原的体液免疫反应、与MHC的相关性等〔4〕。RA主要病理改变为滑膜炎，滑膜细胞增殖具有锚着非依赖性生长、失去接触抑制、凋亡减少及侵蚀性等类似肿瘤生长的特点。滑膜细胞这种类肿瘤样增殖和大量炎症细胞的浸润，导致局部毛细血管氧弥散距离及耗氧量的增加，进而造成一个低氧微环境。HIF?1α具有广泛的靶基因谱，其中既包含与炎症发展、细胞代谢、血管生成相关的基因，也涉及与肿瘤生长、转移有关的基因，已发现超过60种基因受其调控〔5〕。Cramer〔6〕等在体外试验中发现将髓系细胞系的HIF?1α基因敲除后，能消除大鼠体内出现的炎症。体内试验也证明在髓细胞HIF?1α基因缺失的急、慢性炎症动物模型中，HIF?1α基因缺失组较野生型组疾病严重程度降低。均提示HIF?1α高表达可加重炎症的程度。本实验提示滑膜HIF?1α表达与CIA大鼠关节炎病变密切相关。体内外实验已证实，抗滑膜血管生成能有效减轻RA病情〔7〕。Tang等〔8〕通过对肿瘤内皮细胞敲除HIF?1α基因后，抑制了VEGF的表达及实体瘤的血管生长，证实了HIF?1α调控VEGF表达的功能。本实验发现，CIA大鼠中VEGF表达显著升高，造模后21～28 d模型组关节肿胀程度最显著，此时VEGF的表达也比其他时间点明显升高。且HIF?1α与VEGF蛋白表达呈显著正相关，提示HIF?1α与CIA大鼠滑膜血管生成密切相关，可能是其参与RA发病最重要的机制之一。高级会计师论文发表

　　本实验结果显示CIA大鼠关节滑膜表达HIF?1α，并与关节炎病情活动、滑膜增生及血管生成密切相关，提示HIF?1α很可能在RA中通过调控一系列下游靶基因，影响滑膜炎的发生、发展。由于RA是“难治之症”，因此，探究HIF?1α在RA的发病机制中所发挥关键作用，很可能是重要的治疗靶点。可通过对HIF?1α进行阻断，从而阻止滑膜炎的发生、发展。有关HIF?1α在RA中的具体作用机制有待进一步研究。