PAFAH基因多态性与1型糖尿病的相关性

【摘要】  　　目的 探讨血小板活化因子乙酰水解酶（PAF?AH）基因G994T和G275A多态性及血浆PAF?AH水平与1型糖尿病的相关性。方法 选择115例1型糖尿病病人(T1DM组)和106例正常对照者（CON组）作为研究对象,采用PCR?RFLP和特异性引物方法测定PAF?AH基因G994T和G275A多态性，采用酶水解底物显色法测定血浆PAF?AH水平。结果 T1DM组G275A位点GA基因型频率显著高于CON组（χ2=4.667，P<0.05）,A等位基因频率两组差异无显著性（χ2=1.976，P>0.05）。TIDM组G994T位点T等位基因频率和GT基因型频率与CON组比较差异无显著性(χ2=0.148、0.072,P>0.05)。与CON组相比，T1DM组PAF?AH活性均明显降低（P=0.000 03）。结论 PAF?AH基因275G→A的点突变可能与1型糖尿病相关。 
【关键词】  1?烷基 2?乙酰甘油磷酸胆碱酯酶 糖尿病 1型 基因型 医学职称论文发表 医学论文发表网 医药论文发表 医学论文发表网站 医学论文发表期刊
　　［ABSTRACT］ Objective To study the relationship between the polymorphism of PAF?AH gene, plasma PAF?AH level and type?1 diabetes mellitus (T1DM). Methods This study consisted of 115 patients with T1DM and 106 controls, the PAF?AH genotype was detected by PCR?RFLP and specific primer method. Activity of plasma PAF?AH in all patients and controls were determined by PAF?AH Assay kit. Results The frequencies of GA genotype on G275A polymorphism were significantly higher in T1DM group than controls (χ2=4.667,P<0.05), but there were no differences in the frequency of A alleles between them (χ2=1.976,P>0.05). The frequencies of  T allele and GT genotype on G994T polymorphism between the T1DM and controls were not significantly different (χ2=0.148，0.072;P>0.05). Compared with the controls, the activity of plasma PAF?AH in T1DM was significantly decreased (P=0.000 03). Conclusion The 275G→A mutation of PAF?AH gene maybe related to type 1 diabebes mellitus. 
    
　　［KEY WORDS］ 1?Alkyl?2?acetylglycerophosphocholine Esterase; Diabetes mellitus, type 1; Geneotype 
    
　　血小板活化因子（PAF）是一种重要的炎症递质，其可参与多种自身免疫性疾病及心血管疾病的发生。PAF乙酰水解酶（PAF?AH）是维持血浆PAF水平的重要因子，其活性降低及由此所导致的PAF活性升高，是许多炎症性疾病包括自身免疫性疾病的重要病理基础。有关资料显示，PAF?AH SNPs影响PAF?AH活性，其中PAF?AH基因第9外显子Val279Phe SNP可导致酶活性完全丧失，PAF?AH基因第4外显子Arg92His SNP可导致酶活性明显下降，其与许多免疫性疾病相关性已得到来自不同种族、不同病种的众多资料证实[1，2]，但其是否与自身免疫性1型糖尿病相关，目前尚不清楚。本文以中国北方汉族人为研究对象，对PAF?AH基因多态性与1型糖尿病相关性进行研究。
　　1  对象和方法
　　1.1  研究对象
　　1.1.1  1型糖尿病组  1型糖尿病病人115例，男60例，女55例；年龄8～57岁，平均（24.78±9.56）岁。均来自青岛大学医学院附属医院内分泌科病房和门诊。纳入标准：① 40岁以前发病；②有自发酮症倾向；③ 初发时，有明显“三多一少”症状；④ 胰岛素和C?肽释放呈低水平曲线；⑤ICA（+）和（或）GAD抗体（+）。115例均为无血缘关系的山东汉族1型糖尿病病人。
　　1.1.2  对照组  106例中,男55例,女51例；年龄18～48岁，平均(20.86±1.37)岁。均为健康体检者。106例均为无血缘关系的山东汉族人,无糖尿病家族史和自身免疫疾病史,血糖正常，排除心、肝、肾等脏器疾病及全身性疾病。
　　1.2  研究方法 
　　1.2.1  外周血基因组DNA提取  采用酚?氯仿法。应用红细胞、白细胞裂解液裂解红、白细胞，加入蛋白酶K后45 ℃过夜。消化后加入等体积新鲜配制的苯酚?氯仿?异戊醇（25∶24∶1）混合液，抽提DNA。双蒸水溶解DNA。
　　1.2.2  目的片段的扩增和基因型分析  ①G275A位点:引物序列为上游5′?CGAAAATAGCTGCTG?GAATA?3′， 下游5′?AGTTCTTGTTGTTTTCAA?GG?3′。扩增第4外显子,片段长度282 bp。反应体系：总体积为20 μL，内含10×PCR缓冲液2 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,DMSO 0.5 μL,2.5 μmol/L上下游引物各1 μL;2.5×106 U/L Taq DNA聚合酶0.3 μL,基因组DNA模板 1 μL(25 ng)；加双蒸水补充至20 μL。PCR 反应条件： 94 ℃预变性5 min,然后94 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，循环35次后72 ℃末次延伸10 min。在总体积15 μL酶切反应体系中加入PCR产物8 μL,Bcl Ⅰ酶5 U,55 ℃消化1 h。取酶切产物10 μL上样于30 g/L的琼脂糖凝胶电泳，于紫外线灯下观察结果并拍照，记录基因型。野生型282 bp的PCR产物中不存在Bcl Ⅰ的识别序列，故酶切后只有一条282 bp DNA片段者为野生型（GG纯合型）。但G→A突变后的个体存在TGATCA识别序列，可以被Bcl Ⅰ切开，故有282、113、169 bp等3条带者为突变杂合子（GA杂合型）。随机选择酶切证实野生型和杂合突变型标本PCR产物各两份测序证实酶切结果。②G994T位点：引物序列为上游A 5′?C?TATAATTTATATCATGCTT?3′， 下游B 5′?TT?TACTATTCTCTTGCTTTAG?3′，下游C 5′?CTA?TAATTTATATCATGCTT?3′,下游D 5′?TCACTAAGAGTCTGAATAAC?3′。AB引物扩增片段的长度为160 bp，AC、AD引物扩增片段长度均为108 bp。反应体系：总体积为20 μL，内含10×PCR缓冲液2 μL,10 mmol/L dNTP 0.5 μL,2.5 μmol/L上下游引物各1 μL;2.5×106 U/uL Taq DNA聚合酶0.3 μL,基因组DNA模板 1 μL(25 ng)；加入双蒸馏水补充至20 μL。 PCR扩增反应条件：采用Touchdown方法，94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，循环5次；94 ℃变性30 s,52 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s，循环30次；最后72 ℃延伸10 min。每一样本针对不同的特异性引物作3个PCR反应，其中引物A和B特异性扩增G994T位点所在的第9外显子的全长，引物A和C扩增野生型目的片段，引物A和D扩增突变型目的片段。只在野生型泳道108 bp部位出现电泳条带的基因型为野生型纯合子GG;同时在野生型泳道108 bp和突变型泳道108 bp部位出现电泳条带的基因型为突变杂合子（GT杂合型）。随机选择部分野生型和突变型个体的第9外显子PCR产物测序，证实分型结果。
　　1.2.3  PAF?AH 活性测定  采用酶水解底物显色法，按试剂盒说明操作,试剂盒购自美国Cayman Chemical公司。
　　1.3  统计学处理
    
　　采用SPSS 11.5软件进行数据处理,计量资料用±s表示，数据间比较采用t检验；计数资料比较用χ2检验。
　　2  结果
　　2.1  两组血浆PAF?AH活性比较
    
　　1型糖尿病组病人PAF?AH活性为（0.015±0.006） mmol/（min·L）,正常对照组为（ 0.021±0.012）mmol/（min·L），两组比较，差异有显著性（P=0.000 03）。
　　2.2  各组等位基因频率及基因型频率比较
    
　　1型糖尿病组G275A位点GA基因型频率明显高于正常对照组（χ2=4.667，P<0.05），A等位基因频率与正常对照组比较差异无显著意义（χ2=1.976，P>0.05),两组中均未发现AA纯合突变型。两组G994T位点T等位基因频率和GT基因型频率比较差异无显著性(χ2=0.148、0.072,P>0.05)，两组中均没发现TT纯合突变型。见表1。
　　表1  两组基因型频率和等位基因频率比较（略）
　　3  讨论
    
　　本研究结果显示，山东汉族人群中G275A位点GA基因型在1型糖尿病病人中出现频率显著增高,提示GA基因型可能是1型糖尿病的危险因素。G275A位点位于第4外显子，该SNPs的存在引起PAF?AH蛋白质中第92位氨基酸Arg→His突变，这种突变改变了PAF?AH的酶动力学性质，降低酶的底物亲和力，延长了PAF发挥作用的时间[3]，间接地增强了PAF的病理作用，从而导致了PAF?AH酶活性的明显降低。BELL等[2]在英国精神分裂症人群和正常对照人群该位点各发现5%的纯合突变型。但本研究无论在正常人群还是在1型糖尿病病人中均未发现纯合型突变个体,提示该位点可能存在种族差异。G994T位点位于PAF?AH基因第9外显子，可导致PAF?AH蛋白质中第279位氨基酸Val→Phe 突变，由于该位点处于PAF?AH酶活性中心，所以突变纯合子可引起酶活性的丧失。本文结果显示，山东汉族正常人群中GT突变杂合子的分布频率为0.23,未发现TT纯合突变;该结果与日本正常人群该位点杂合突变结果（0.27）相近,与1型糖尿病病人比较差异无显著性。
    
　　PAF是一种具有多种生物学功能的磷脂，参与促炎症反应细胞如血小板、中性粒细胞、巨噬细胞的信号转导和活化，抑制B细胞的凋亡。因此，PAF参与多种炎症疾病和变态反应性疾病的发生和发展。PAF?AH是PAF主要代谢酶，特异性作用于PAF甘油骨架的sn?2位乙酰基，将其水解为无活性lyso?PAF。人类PAF?AH基因位于第6染色体6p21.2?p12，该区域通常被认为是1型糖尿病主要易感基因——人类白细胞抗原（HLA）所在区域。
    
　　1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，与T淋巴细胞和巨噬细胞活化导致单核细胞浸润有关。在1型糖尿病的前临床阶段——胰岛素炎阶段，粒细胞包绕并浸润胰岛朗罕细胞，血浆中IL?6和 TNF?α水平均有明显增高[4]，提示炎症?免疫应答被激活。SANKARANAND等[5]在1型糖尿病小鼠中发现编码炎症细胞因子的基因转录水平增高，编码细胞聚集、归巢和凋亡相关的基因也明显上调。PAF?AH水平升高可减轻PAF介导的上述炎症递质效应。此外，国内外研究证明，儿童和青少年1型糖尿病病人中存在氧化和抗氧化失衡，氧化应激增强。氧自由基介导的脂质过氧化反应和细胞毒素乙醛都导致细胞因子对胰岛β细胞的损伤。脂质过氧化产物还可以导致血管收缩和血小板黏附聚集，是引起动脉粥样硬化、高血压、糖尿病肾病等1型糖尿病并发症的主要原因。研究结果还表明，随着病程的延长，1型糖尿病病人三酰甘油、总胆固醇水平逐渐增高[6]。PAF?AH可阻止低程度氧化的LDL分子体外形成及其细胞内摄取，因此在氧化过程中起重要的保护作用。由此可见，PAF?AH酶活性降低可能影响Ⅰ型糖尿病及其慢性并发症的发生和发展。由于G275A位点或G994T位点纯合突变可导致酶活性完全丧失，因此我们推测上述纯合突变可能是1型糖尿病及其血管并发症的重要易感因素。但本研究未检测到纯合突变基因型，可能与样本量少及国家、民族的差异有关。虽然本研究所选取的人群存在地域分布的局限性，但中国汉族人群相对均一性较好,遗传背景基本相同。尽管如此，也应在不同地域的人群中进行类似研究，以消除地域偏倚，同时也应在家族连锁不平衡研究中寻找更多的证据。
    
　　综上所述，中国北方汉族1型糖尿病病人血浆PAF?AH活性明显低下，PAF?AH G275A可能是导致PAF?AH活性低下的内在原因之一，与1型糖尿病有关。PAF?AH作为体内调节血浆PAF的主要因子，除与自身免疫性疾病的发生、发展有关外，与动脉粥样硬化性疾病，特别是糖尿病大血管和微血管并发症也可能存在关联。对此进行深入研究，对揭示糖尿病血管并发症发病机制，开发新的治疗药物有重要意义。
【参考文献】
  　　[1]YAMADA Y, YOSHIDA H, ICHIHARA S, et al. Correlations between plasma platelet?activating factor acetylhydrolase (PAF?AH) activity and PAF?AH genotype, age, and atherosclerosis in a Japanese population[J]. Atherosclerosi, 2000,150:209?216. 
　　[2]BELL R. Systematic screening of the LDL?PLA2 gene for polymorphic variants and case?control analysis in schizophrenia[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997,241:630?635.

　　[3]SUSANNE K, MAO X Q, ANDREA H, et al. The Ile198Thr and Ala379Val variants of plasmatic paf?acetylhydrolase impair catalytical activities and are associated with atopy and asthma[J]. Am J Hum Genet, 2000,66:1522?1530.

　　[4]DAVìG, CHIARELLI F, SANTILLI F, et al. Enhanced lipid peroxidation and platelet activation in the early phase of type 1 diabetes mellitus: role of interleukin?6 and disease duration[J]. Circulation, 2003,107:3199?3203.

　　[5]SANKARANAND S, JENINE M, BELL I, et al. Dynamic interaction between T cell?mediated and repair in the run up to autoimmune diabetes of the NOD mouse[J]. Physiol Genomics, 2005,21:201?211.

　　[6]贾兆通,田凯华. 病程对1型糖尿病血脂、血尿酸及并发MS的影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2007,43：487?489.