LMP1基因沉默对EBV阳性上皮细胞凋亡和增殖影响

作者：冯艺 王笑峰 王云 罗兵 医学职称论文发表 医学论文发表网 医药论文发表 医学论文发表网站 医学论文发表期刊

【摘要】  　　目的 探讨化学合成小干涉RNA（siRNA）对Epstein?Barr病毒（EBV）潜伏膜蛋白1（LMP1）阳性胃上皮（GT38）细胞LMP1编码基因表达的抑制作用，以及对细胞增殖和凋亡的影响。方法 化学合成靶向LMP1 mRNA不同位点的3对siRNA，分别转染GT38细胞，选择干扰效果最佳的siRNA进行实验研究，行RT?PCR、Hochest 33258荧光染色及流式细胞术分析。结果 RT?PCR结果显示，3对靶向LMP1的siRNA均能抑制GT38细胞LMP1的转录表达，以靶向LMP1 mRNA 649位点的siRNA作用效果最强。Hochest 33258荧光染色可见siRNA649作用后的GT38细胞发生凋亡。流式细胞分析显示，siRNA649作用24、72以及120 h后的细胞其细胞周期无明显改变。RT?PCR检测结果表明，转染siRNA649的靶细胞Bcl?2的表达水平降低。结论 靶向LMP1的特异性siRNA可以有效抑制LMP1的转录表达，进而可能通过抑制Bcl?2的表达诱导靶细胞凋亡。GT38细胞系可作为研究LMP1生物活性及其在EBV相关肿瘤发生中所起作用的理想的靶细胞。 
【关键词】  Epstein?Barr病毒 潜伏膜蛋白1 RNA干扰 小干涉RNA 细胞凋亡
　　［ABSTRACT］ Objective To explore the relationship between specific silencing effect of siRNA that targets latent membrane protein 1 (LMP1) coding gene on the proliferation and apoptosis of EBV positive gastric epithelium cells. Methods The chemically synthetic siRNA targeting LMP1 was transfected into target cells,then RT?PCR, Hochest 33258 staining and flow cytometry were used to detect apoptosis and cell cycle of target cells,respectively. Results  RT?PCR showed that siRNAs markedly inhibited the expression of LMP1 in target cells,and the effect of siRNA649 was most obvious. Apoptosis was observed in target cells transfected by siRNA649 with Hochest 33258 staining. A flow cytometry analysis showed no obvious discrepancy after 24, 72 and 120 h of transfection of siRNA649. RT?PCR showed that siRNA649 inhibited the expression of Bcl?2 in target cells.  ConclusionChemically synthetic siRNA targeting LMP1 gene could effectively silence the expression of LMP1. Then it may though suppressing the expression of Bcl?2 lead target cells apoptosis. This cell line can be used as a good target cell to explore LMP1 bioactivity and its effect in oncogenesis of EBV correlated tumors.
    
　　［KEY WORDS］ Epstein?Barr virus; Latent membrane protein 1; RNA interference; siRNA; Apoptosis
    
　　EB病毒(Epstein?Barr virus，EBV) 是重要的DNA肿瘤病毒，该病毒与鼻咽癌(NPC)、Burkitt淋巴瘤(BL)、胃癌(GC)等多种肿瘤的发生有关[1]。在EBV编码基因中，潜伏膜蛋白1（LMP1）编码基因已被确认具有癌基因的功能[2]。近年来的研究结果表明，LMP1具有介导细胞增殖、抑制细胞凋亡的功能；LMP1表达还可抑制细胞分化，与鼻咽癌的低分化有关，并能促进肿瘤的侵袭和转移[3～6]。小干涉RNA（siRNA）能高效、特异地阻断体内特定基因的表达，诱使细胞表现出特定基因缺失表型。本研究选择EBV阳性胃上皮（GT38）细胞作为靶细胞，采用人工合成的siRNA特异性阻断LMP1的表达，检测LMP1沉默对GT38增殖和凋亡的影响，旨在探讨LMP1在EBV相关肿瘤发生发展中的分子机制，为EBV相关肿瘤的生物治疗提供实验依据。
　　1  材料和方法
　　1.1  实验材料
　　1.1.1  主要试剂  DMEM培养基、胎牛血清以及OPTI?MEM I培养基均购自美国GIBco公司。LipofectamineTM2000和TRIzol均购自Invitrogen公司。逆转录试剂盒购自美国Promega公司。碘化丙啶(PI)、Hochest 33258购自美国Sigma公司。
　　1.1.2  靶细胞  EBV阳性GT38细胞由日本鸟取大学医学部生体情报学教室西连寺刚教授惠赠，用作该实验的靶细胞。
　　1.2  实验方法
　　1.2.1  靶向LMP1基因寡核苷酸的设计  本文靶向LMP1基因的siRNA、荧光标记的siRNA（FAM?siRNA）以及非特异性siRNA，均由广州锐博生物科技有限公司合成。经过Blast确定靶向LMP1基因siRNA的特异性及非特异性siRNA与人的mRNA无同源性。序列见表1。
　　表1  siRNA序列货号LMP1靶向位点（略）
　　1.2.2  siRNA转染效率的检测  将GT38细胞接种于24孔细胞培养板中，待细胞生长至30％～50％汇合时，采用脂质体法分别以20、30、50、80和100 nmol/L终浓度的FAM?siRNA在OPTI?MEM I培养基中转染细胞，在37 ℃，体积分数0.05的CO2培养箱中培养6～8 h后，更换为含体积分数为0.10的胎牛血清不含双抗的培养基。转染12 h内用倒置荧光显微镜检测转染效率，转染效率=荧光细胞的数量/相同视野下的细胞总数×100％。靶向LMP1的siRNA和非特异siRNA的转染方法与FAM?siRNA的转染方法相同。
　　1.2.3  半定量RT?PCR检测LMP1、Bcl?2、Bax mRNA转录水平  将特异性siRNA以50 nmol/L终浓度分别转染GT38细胞，分别于转染后24、48和72 h收集细胞，TRIzol一步法提取细胞总RNA。按照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PCR模板。扩增LMP1、Bcl?2、Bax基因和内参照基因GAPDH的引物参照文献[7,8]设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，扩增产物分别为490、318、257和450 bp。PCR扩增产物于含溴化乙锭（0.5 mg/L）的15 g/L琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统分析电泳结果。
　　1.2.4  Hochest 33258染色实验  将无菌玻片置于6孔板内，接种GT38细胞37 ℃培养至细胞汇合度约为40％时，以20和50 nmol/L终浓度siRNA转染，同时设非特异性对照组及细胞对照组，置于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中培养48 h。取出盖玻片用PBS洗净，加0.5 mL固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)4 ℃固定5 min，去固定液，用PBS冲洗2次，加终浓度5 mg/L的Hochest 33258避光染色10 min，PBS漂洗后封片，荧光显微镜观察。
　　1.2.5  流式细胞分析  收集转染siRNA后24、72和120 h的GT38细胞以及细胞对照，制备单细胞悬液，PBS洗2次，调整细胞浓度为5×109/L，加体积分数0.70冷乙醇4 ℃固定24 h以上。PBS洗2次除尽乙醇，300目不锈钢细胞筛过滤去除细胞团块，加RNase至终浓度0.5 g/L，PI染液至终浓度50 mg/L，暗室孵育30 min，流式细胞仪检测分析。
　　1.2.6  统计学方法  实验数据采用SPSS 11.5软件，统计处理以3次重复实验测定值的±s表示，组间比较用方差分析，P<0.05为差异有显著统计学意义。
　　2  结果
　　2.1  siRNA转染效率的检测
    
　　FAM?siRNA转染GT38细胞后12 h各浓度组在荧光显微镜下均可观察到细胞内有点状绿色荧光出现，表明转染成功。随机计数5个视野下的细胞数量，计算转染效率，取3次实验的平均值。20、30、50、80和100 nmol/L终浓度siRNA转染效率分别为40.2%、47.9%、90.3%、90.4%和89.7%。表明当siRNA终浓度为50、80和100 nmol/L时转染效率较高，因此，实验中选用50 nmol/L浓度siRNA转染GT38细胞。
　　2.2  不同siRNA对LMP1 mRNA转录表达影响 
    
　　选用50 nmol/L终浓度siRNA转染GT38细胞，转染48 h后LMP1 mRNA表达量均有不同程度下降，RT?PCR检测结果见图1。统计分析结果显示，转染非特异性siRNA组LMP1/GAPDH为0.51±0.03，转染siRNA649组LMP1/GAPDH为0.09±0.00，转染siRNA979组LMP1/GAPDH为0.31±0.02，转染siRNA1348组LMP1/GAPDH为0.43±0.02。与转染非特异性siRNA的细胞相比，siRNA649、siRNA979和siRNA1348对靶细胞LMP1的表达均具有明显抑制作用，差异有统计学意义（F=235.99，P<0.05），其中以siRNA649对LMP1转录表达的抑制作用更强，故择其实验。
　　2.3  siRNA649对LMP1 mRNA表达影响的时效关系
    
　　选用50 nmol/L终浓度siRNA649转染GT38细胞，RT?PCR检测LMP1 mRNA的转录表达。电泳结果显示，与细胞对照比较，转染后24、48和72 h对GT38细胞LMP1的转录表达均有抑制作用，结果见图2。统计学分析结果显示，siRNA649?24 h组LMP1/GAPDH为0.32±0.03，siRNA649?48 h组LMP1/GAPDH为0.08±0.02，siRNA649?72 h组LMP1/GAPDH为0.15±0.06，GT38细胞对照组LMP1/GAPDH为0.77±0.09。转染后24、48和72 h时LMP1 mRNA的转录水平均明显低于细胞对照组，差异有显著性（F=89.93，P<0.05），而转染后48和72 h时LMP1表达水平明显低于转染后24 h时LMP1的表达水平（P<0.05）。
　　2.4  Hochest 33258染色观察细胞凋亡
    
　　采用Hochest 33258荧光染料对活细胞进行染色，在波长为365 nm荧光显微镜下观察，可见对照组细胞核呈均匀淡蓝色的椭圆形或圆形，边界清晰。20和50 nmol/L浓度siRNA649作用48 h后均能观察到具有典型凋亡特征的GT38细胞，细胞核呈亮蓝色的半月形、马蹄形，边界清晰，出现凋亡细胞染色质的边集、核浓缩或聚集现象；有的细胞核则呈3个或3个以上的荧光碎块，结果见图3。各组分别随机计数200个细胞，20 nmol/L终浓度转染组出现凋亡细胞数较少为20%（40/200），50 nmol/L组凋亡细胞占30%（60/200）。
　　2.5  流式细胞分析
    
　　收集50 nmol/L终浓度siRNA649转染后24、72和120 h的细胞以及细胞对照，流式分析细胞周期。参考文献[9]计算细胞增殖指数(PI)：PI=(S+G2)/(G1+S+G2)×100％。统计学分析结果显示，各组间差异无显著性（F=5.71，P>0.05），说明本实验中siRNA649对GT38细胞的周期无明显影响。见表2。
　　表2  各组转染siRNA649后不同时间的PI比较（略）
　　2.6  siRNA649对Bcl?2和Bax mRNA表达影响
    
　　选用50 nmol/L终浓度siRNA649转染GT38细胞，分别于转染后24、48和72 h时提取各组细胞总RNA，RT?PCR检测Bcl?2、Bax mRNA的转录表达。电泳结果显示，与细胞对照比较，转染后24、48和72 h对GT38细胞Bcl?2的转录表达均有抑制作用，而对Bax的转录表达无明显影响，Bcl?2/Bax降低。统计学分析结果显示，GT38细胞对照组Bcl?2/Bax为4.61±1.94，siRNA649?24 h组Bcl?2/Bax为0.56±0.51，siRNA649?48 h组Bcl?2/Bax为1.23±0.91，siRNA649?72 h组Bcl?2/Bax为1.77±1.48。转染后24、48和72 h时Bcl?2/Bax mRNA的转录水平均明显低于细胞对照组（F=5.45，P<0.05）。见图4。
　　3  讨论
    
　　研究结果表明，LMP1编码基因是EBV永生化基因中唯一能够转化体外培养的人和啮齿类动物细胞并使之具有致瘤性的基因[10]。除转化B细胞外，LMP1还可在体外转化哺乳动物纤维母细胞和人角质细胞，抑制人上皮细胞的分化，诱导表皮生长因子受体的表达等，从而表明LMP1在非淋巴细胞肿瘤的发病中具有重要作用，是公认的EBV致癌基因。LMP1和细胞信号传递密切相关，研究证实LMP1 可以通过多种途径抑制细胞凋亡[11]，参与EBV相关的肿瘤发生。因此，如何通过干扰LMP1基因表达以诱导EBV阳性肿瘤细胞凋亡或降低其恶性程度成为EBV相关肿瘤研究的热点。大多数研究结果表明，EBV相关胃癌（EBVaGC）不表达LMP1，只有个别研究在部分EBVaGC组织中检测到LMP1的表达[12]。本研究选择的靶细胞GT38是TAJIMA等[13]于1998年从1名69岁中分化胃腺癌病人的癌旁组织中分离建立的细胞系，能使SCID小鼠致瘤[14]。该细胞CD19和CD3分子均为阴性，而细胞角蛋白阳性，表明其为上皮来源。与大多数EBVaGC组织中LMP1不表达不同，EBV在GT38细胞中为Ⅲ型潜伏状态，能够稳定地表达LMP1、EBNA1和EBNA2；且GT38细胞为贴壁生长的上皮细胞，易采用脂质体法进行转染，实验操作简便。
    
　　本实验采用脂质体法转染不同浓度荧光标记的阴性对照siRNA以确定转染效率，结果显示，各浓度组细胞内均可观察到绿色荧光，转染效率在20～50 nmol/L范围呈浓度依赖性增高，当siRNA浓度大于50 nmol/L时转染效率无明显变化。考虑到荧光淬灭、进入细胞siRNA量少等因素，可能还有部分成功转染的细胞未能观察到荧光，推测实际转染效率应高于检测值，提示脂质体适用于人工合成siRNA对GT38细胞的转染。 我们根据LMP1基因的不同区域，设计3组不同的siRNA，从而验证不同的区域是否对siRNA介导的降解更为敏感，采用RT?PCR检测LMP1的转录表达来评价沉默效应。研究结果显示，3对人工合成的siRNA均能特异性沉默LMP1的转录表达，干扰作用具有特异性，其中以靶序列位于LMP1重要功能区（第四功能区内）的siRNA 649干扰作用最为明显，说明针对功能区设计的siRNA更能有效地沉默靶基因。转染后24 h即检测到靶基因mRNA转录水平的下降，48 h时siRNA的抑制作用最强，有效阻抑时间可持续72 h，分析与siRNA降解及细胞增殖导致siRNA绝对浓度下降有关。 
　　图1  不同序列siRNA对LMP1 mRNA转录表达的影响（略）
    
　　①PCR Marker DL2000，②、③转染非特异性siRNA 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA表达，④、⑤转染siRNA649 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA的表达，⑥、⑦转染siRNA979 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA的表达，⑧、⑨转染siRNA1348 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA的表达
　　图2  转染siRNA649后不同时间对LMP1 mRNA表达的影响 （略）
    
　　①、②转染siRNA649 24 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA的表达，③、④转染siRNA649 48 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA表达，⑤、⑥转染siRNA649 72 h后LMP1 mRNA和GAPDH mRNA表达，⑦细胞对照LMP1 mRNA表达，⑧细胞对照GAPDH mRNA， ⑨PCR Marker DL2000
　　图3  靶细胞的Hochest 33258染色结果（略）
    
　　A：对照组GT38细胞，B：50 nmol/L终浓度转染siRNA649后的GT38细胞(×400)
　　图4  转染siRNA649后不同时间Bcl?2、Bax mRNA 表达变化（略）
    
　　①PCR Marker DL2000， ②GT38细胞对照中Bcl?2 mRNA的表达，③～⑤分别为转染siRNA649 24、48、72 h后Bcl?2 mRNA的表达，⑥GT38细胞对照中GAPDH mRNA表达， ⑦～⑨分别为转染siRNA649 24、48、72 h后GAPDH mRNA的表达，⑩GT38细胞对照中Bax mRNA的表达，～转染siRNA649 24、48、72 h后Bax mRNA的表达
　　细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为3期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱ期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅲ期的细胞核裂解为碎块，形成凋亡小体。在转染特异性siRNA的细胞中同时存在这3期表现，而对照组细胞染色均匀，表明siRNA可诱导细胞发生凋亡。

典型的细胞周期包括有严格顺序的4个期，即G1期(DNA合成前期)→S期(DNA合成期)→G2期(DNA合成后期)→M期(分裂期)；细胞的DNA合成和有丝分裂期是细胞增殖的两个重要指标，两者之和称为增殖指数。G1→S期的调控点称“启动点”或限制点，位于G1期末，DNA合成的起始。有学者研究发现，与肿瘤发生密切相关的细胞周期缺陷主要发生在细胞周期限制点及G1期DNA损伤检查点，尤其以G1?S的调控更为重要[15]。本研究结果显示，siRNA649作用不同时间后的细胞增殖指数无明显改变，原因可能是各期细胞的多少只代表细胞停留在这一时相的时间长短，并不真正代表进入细胞增殖周期的细胞数量。因此，LMP1基因沉默对GT38细胞周期的影响仍需进一步探讨。LMP1能够介导功能不同甚至功能相反的基因表达，LMP1介导的基因表达与其表达持续时间和表达水平相关，不同表达水平和不同表达时间介导的基因表达谱不同；在不同细胞、不同条件下，LMP1具有促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡的双重生物学效应[16]。有研究结果表明，LMP1表达可通过上调Bcl?2的作用而抑制人B淋巴细胞的凋亡[17]。刘克拉等[18]的研究则显示，人鼻咽癌组织中的LMP1与Bcl?2的表达无相关性，Bcl?2的表达也不能抑制鼻咽癌细胞凋亡。另有研究显示，多数组织表达少量的Bcl?2，其表达水平在不同的细胞及组织不同。例如，在皮肤和黏膜组织中，基底细胞和黏膜干细胞表达Bcl?2，而位于表面的细胞极少甚至不表达；结直肠黏膜在生理范围内表达高水平的Bcl?2，但胃黏膜几乎检测不到Bcl?2的表达。
    
　　Bcl?2和Bax同属于Bcl?2蛋白家族，分别具有抑制和促进细胞凋亡功能，在细胞凋亡的调控发生中发挥重要的调节作用。分布于线粒体外膜上的Bcl?2蛋白通过稳定线粒体膜，防止线粒体内促凋亡相关蛋白泄漏至胞质及阻断Ca2+从内质网释放，使依赖Ca2+的核酸内切酶活性降低等途径阻断细胞凋亡[19]。Bax是Bcl?2基因家族中的细胞凋亡促进基因，具有抑制Bcl?2、进而促进细胞凋亡的作用。目前认为 Bax和Bcl?2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡：当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl?2形成异源二聚体时则抑制细胞凋亡。本研究表明，在具有恶性性质的胃上皮细胞GT38中Bcl?2基因在mRNA水平呈阳性表达；干扰LMP1后，对GT38细胞Bcl?2的转录表达有抑制作用，而对Bax的转录表达无明显影响，Bcl?2/Bax降低。推测本实验干扰LMP1后，Bcl?2表达下调，Bax蛋白占优势，发生构象改变，形成同源二聚体，进而活化凋亡的级联反应，最终导致细胞凋亡。
    
　　肿瘤细胞中EBV主要以潜伏感染的形式存在，根据其潜伏期基因的表达情况，分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型潜伏，LMP1为EBVⅡ型和Ⅲ型潜伏时表达的病毒基因。EBV的Ⅲ型潜伏通常见于体外EBV永生化的B淋巴母细胞系和某些免疫缺陷病人的B淋巴细胞增生性疾病，该类细胞系多呈悬浮生长，不适合用脂质体法进行转染；而EBVⅡ型潜伏的细胞系多见于鼻咽癌细胞系。我们首次采用LMP1稳定表达的具有恶性性质的胃上皮细胞进行实验研究，结果显示人工合成的siRNA可有效沉默靶细胞LMP1的转录表达，进而引起某些细胞表型的改变，表明GT38细胞可用作深入探讨LMP1生物学功能的理想靶细胞。此外，鉴于大多数EBVaGC组织不表达LMP1，该细胞系对进一步阐明LMP1在EBVaGC发生发展中的作用具有重要意义。
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