5?羟色胺在大鼠海马CA1、CA2、CA3脑区的分布与表达

海马(hippocampus)属于大脑的边缘系统，包括CA1、CA2、CA3和CA4区。CA4区邻接齿状回，CA1区与副下托相连，在结构上无明显分界标志，功能上可视为一个整体。有实验研究表明，海马是学习、记忆的关键或中心〔1〕。但学习和记忆功能的实现需要多个脑区综合作用，并不局限于大脑的某个特定区域〔2〕。外界信息通过眼、耳等感觉器官接受传导、转化，然后通过海马整合处理、存储，最后经穹窿传出。5?羟色胺(5?HT)是一种在中枢神经系统广泛分布的神经递质，主要参与情感、睡眠、疼痛、学习记忆等复杂生理功能的调节。5?HT胞体位于脑干的中缝核团，它发出的投射纤维广泛分布在脑的各部。舒斯云等〔3，4〕发现纹状体边缘处(Marginal division,Mrd)有5?HT免疫阳性纤维及终末分布，揭示了纹状体边缘处是学习记忆另一个新区。但5?HT在海马内CA1、CA2 、CA3和CA4区的表达和对学习记忆的作用少有报道。本实验重点观察大鼠海马CA1、CA2和CA3每个区域阳性神经元的数目、形状和密度，为进一步研究5?HT在海马学习、记忆的作用机制提供形态学依据。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠8只，体质量200～250 g(由大连医科大学实验动物中心提供)。

　　1.2 主要试剂和仪器 山羊超敏二步法免疫组化检测试剂和二氨基联苯胺(DAB)(购自北京中杉金桥)。恒冷箱切片机：德国徕卡公司。Olympus万能显微镜：日本Olympus公司。

　　1.3 灌注固定 在麻醉缸先取乙醚把大鼠基础麻醉，然后经10%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔麻醉后，仰卧固定，用剪刀打开胸腔，将穿刺针经左心室插入升主动脉，剪开右心耳，先用150 ml生理盐水快速冲洗后，给予4%多聚甲醛磷酸缓冲液(PBS)300 ml灌注，前100 ml快灌,后200 ml慢灌，持续灌注4 h后断头开颅取脑，放入相同固定液中4℃过夜。振动切片机或恒冷箱切片机连续冠状切片，片厚30 μm,选取具有海马的切片,隔一张选取一片，每一只大鼠中取8张切片，置入0.01 mol/L的PBS(pH7.4)溶液中备用。

　　1.4 免疫组织化学法 采用二部法进行免疫组织化学染色，步骤如下：①新鲜配制的3%H2O2室温孵育10 min,以消除内源性过氧化物酶的活性。②PBS溶液冲洗3次×5 min。③加0.1% Triton?100,10 min摇匀。④加一抗，即鼠抗5?HT(北京中杉金桥生物技术有限公司提供，浓度1∶1 000)4℃冰箱中过夜。⑤PBS溶液冲洗3次×5 min;⑥加试剂2(北京中杉金桥生物技术有限公司提供的山羊超敏二步法免疫组化检测试剂盒，即用型)，常温下1 h。⑦PBS溶液冲洗3次×5 min。⑧DAB呈色3～5 min(按1 000 ml双蒸水中加30 μl DAB原液配制)。⑨PBS溶液终止染色。⑩脱水、透明、封片。空白对照切片采用PBS液代替一抗，其余步骤与前相同。在10×20的光镜下进行5?HT阳性细胞计数，每一张切片随机抽取3个视野区域观测，每一区域规定160 μm×160 μm面积大小,每一格40 μm,在规定的区域中观察和计算5?HT阳性神经元在海马中CA1、CA2和CA3区的分布特点及数目。水利论文发表

　　1.5 统计学分析 在Nikon(ECLIPSE80i)正置荧光显微镜图像分析仪观察拍摄，所得图像用自带的分析软件并行有关数据分析。采用SPSS11.5统计软件进用单因素方差分析和多重比较检验LSD法，所得数据采用x±s表示。

　　2 结 果

　　5?HT免疫反应阳性产物为棕黄色，位于胞核周围，细胞核透明，未见明显染色。阳性产物在海马中CA1、CA2和CA3三个区域分布较多，分别为5.6±1.07、5.7±1.25、3.5±1.26，尤其在锥体层细胞中分布最多。每个区域中分子层细胞呈梭形或星形，分布较少，细胞染色强烈，锥体层细胞从内到外排列整齐，密集成带，无明显差异。CA3区分子层细胞以梭形为主，细胞较大，细胞染色比CA1区弱。空白对照切片为阴性,未见CA1、CA2、CA3表达阳性神经元胞体。见图1，表1，表2。表1 三组资料的单因素方差分析结果　图1 5?HT在海马CA1、CA2、CA3区的表达表2 三组资料的两两比较结果
3 讨 论

　　学习记忆是人类和动物的高级功能之一，现在认为最可能参与记忆痕迹形成的脑区结构是海马、小脑、杏仁体和大脑的前额叶皮层及颞叶皮层〔2，4〕。研究表明，毁损双侧海马和海马的不同区域都能影响人和动物学习记忆形成和维持〔5，6〕。海马的学习记忆功能是通过海马神经环路实现的。接受新皮质信息的海马其传出纤维经穹隆至下丘脑乳头体，下丘脑发出乳头丘脑束至丘脑前核，丘脑前核发出纤维至扣带回，而扣带回又发出纤维至海马。其机制是海马突触结构和功能的可塑性，通过突触传递效能的长时程增强(LTP)或突触传递效能长时间易化作用实现的。其分子物质机制为兴奋性神经递质谷氨酸(Glu)和其受体红藻氨酸(KA)/α?氨基羟甲基恶唑丙酸(AMPA)结合，激活了N?甲基?D?天门冬氨酸(NMDA)受体的离子通道，产生LTP。它是一种特殊的离子通道蛋白，即受电压的调控也同时受神经递质的影响，只有当动作电位到来而Glu又同时从突触前膜释放并与受体结合之后，NMDA受体才起作用，并打开离子通道，让Na+和Ca2+由细胞外流入细胞内，产生兴奋性突触后电位(EPSP),而Ca2+内流又通过第二信使系统触发一系列的生化反应，促进蛋白质的合成和一些特殊基因的表达〔7～9〕。水利论文发表

　　Ogren等〔10〕报道运用一种5?HT释放剂注射后能降低大脑皮层、海马及纹状体中的5?HT水平，产生剂量依赖性逃避学习及保持功能损害。本实验通过免疫组化技术对正常大鼠海马的光镜观察，发现5?HT递质阳性神经元胞体在CA1、CA2和CA3中广泛分布。说明大脑的边缘系统海马也有5?HT能神经元存在。其作用为5?HT神经递质能使以海马为中心的神经环路中产生突触前易化和长时敏感化并伴有突触结构的变化。海马中间神经元受到刺激被激活后，含有5?HT神经递质的突触小泡释放更多的5?HT，5?HT多次作用于感觉神经元胞浆或胞膜中5?HT受体，使神经元内的cAMP浓度明显升高，促进蛋白激酶A(PKA)的调节亚单位和催化亚单位分离，PKA的催化亚单位转位至细胞核内使转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化，激活有关调节基因和效应的转录和表达，使细胞核内合成新的蛋白质，递质释放持续增多以及调节突触结构的变化〔11〕。以往实验研究表明，某些神经递质和神经肽能够在质和量上发生变化，即具有可塑性〔12〕。当神经活动时，在固定的神经环路无需改变细胞间的回路，无需形成新的突触，就可改变递质的表型从而达到改变信息交流的目的。经用荧光标记在海兔分离培养的感觉神经元?运动神经元突触上，在5?HT递质多次运用后24 h，感觉神经元曲张体数目显著增加。这种突触结构形态的变化与运动神经元兴奋性突触后变化的长时程增强呈正相关关系〔13〕。

　　本实验还发现海马内细胞数CA1与CA2区无差异，CA1、CA2与CA3区细胞数之间有统计学差异;用免疫组化技术通过观察5?HT递质在大鼠边缘系统海马的表达，从形态学上再一次证实了5?HT在海马学习记忆的神经调节作用。但海马中5?HT2A受体亚型的分布特点及作用机制以及CA1、CA2区细胞数比CA3多，其分布原因，还需进一步研究。