CD59基因的突变并真核表达载体的构建

 作者：朱新红 高美华 任书荣 王秋波 王静 林存智

【摘要】  　　目的 构建两种活性位点相关性CD59突变基因，并重组入真核表达载体。方法 选取物种间高度保守W40位点及相邻位置为突变位点，重叠延伸PCR(Overlap extension PCR)法构建两种CD59基因点突变，一种是编码W40的密码子TGG缺失突变，另一种是C39W40K41→W39W40W41的相应基因突变，各设计两条常规引物和两条反向互补突变引物,以已构建CD59 cDNA为模板,三重PCR 定点诱变扩增突变基因, 重组入克隆载体PMD18?T?Vector, EcoRⅠ单酶切获得目的基因，重组入真核表达载体pIRES。结果 通过PCR定点诱变成功获得两种目的CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定结果均证实成功构建了pIRES?m1CD59、pIRES?m2CD59重组真核表达载体系统,突变CD59基因长度约500 bp。结论 重叠延伸 PCR法诱变经济可靠，重组质粒的构建为进一步研究CD59的抗补体活性奠定了基础。 
【关键词】  抗原 CD59 点突变 真核表达
　　［ABSTRACT］ Objective To construct two CD59 active site relative mutagenesis and clone mutants into eukaryotic expression system. Methods The highly conserved W40 and its vicinity were selected for mutant, and site?directed mutagenesis with deleting residue W40 site and changing C39W40K41→W39W40W41 were performed by Overlap extention PCR. Two normal primers and two mutagenesis reverse complemented primers were designed. cDNAs as templates,tri?PCR were used to amplify the mutant genes. Mutant CD59 DNAs were subcloned into the cloning vector PMD18?T?Vector, then cloned into the eukaryotic expression vector pIRES after digested by EcoRⅠ. Results Mutants were successfully constructed and confirmed by sequence analysis. Recombinant plasmids of pIRES?m1CD59 and pIRES?m2 CD59 were successfully constructed according to sequence and enzyme digestion analysis. The mutant gene was about 500 bp. Conclusion Overlap extension PCR is economical and in reliable, and the recombinants will be applied for 医学职称论文发表 医学论文发表网 医药论文发表 医学论文发表网站 医学论文发表期刊 futher study on CD59 anticomplement activity.
    
　　［KEY WORDS］ Antigens, CD59; Point mutation; Overlap extension PCR; Eukaryotic expression
    
　　补体是由一系列不耐热因子组成，广泛参与机体防御反应及免疫调节，也可介导免疫病理损伤性反应。机体细胞防止自身攻膜复合体（MAC）的破坏是由GPI锚定糖蛋白CD59完成的[1]。CD59的作用是与MAC装配过程的C8  和(或)C9结合, 干扰C9的膜插入或多聚化，阻止膜孔道的形成[1,2]。人CD59前体是由128个氨基酸组成的多肽链，成熟蛋白有77个氨基酸，由半胱氨酸富集区组成的两个反向平行 片层、5个突出表面的环状结构和一个短螺旋结构排列组成[3]。人CD59广泛分布于血液细胞及各种组织细胞表面。近年来发现，CD59在肿瘤细胞表面过表达，提示CD59与促进肿瘤的生长及保护肿瘤细胞逃逸抗体诱导的补体杀伤有关[4]。研究显示，CD59在肠、卵巢、前列腺、肺、肾、子宫内膜癌及淋巴瘤等多种肿瘤细胞表面过表达。因此，了解CD59与补体配体之间相互作用的分子结构，有助于帮助设计CD59抑制物以提高补体杀伤肿瘤的效果。通过NMR结构分析，CD59与补体结合的部位在53位精氨酸6×10-10m范围，包括W40的一个疏水性凹槽内[5]。本研究选择物种间高度保守的W40位点基因及相邻碱基,应用重叠延伸PCR法进行点突变，构建两种突变CD59的真核表达系统，以便进一步研究CD59的抗补体活性，从而推断W40及其相邻氨基酸的生物学作用。现将结果报告如下。
　　1  材料与方法  
　　1.1  试剂
    
　　人CD59 cDNA?pALTER重组质粒由美国哈佛大学医学院提供,该重组质粒含有pT7 、T3 RNA聚合酶启动子及EcoRⅠ 酶切位点、信号肽、CD59 cDNA序列;真核表达载体pIRES购自TakaRa 公司;PMD18?T?vector, EcoRⅠ内切酶, T4 DNA连接酶, Marker DL2000购自Takara(Japan), Taq DNA聚合酶购自Promega(Madison, WI, USA);E.coli JM109由本室保存。
　　1.2  主要仪器和设备
    
　　高速低温冷冻离心机（日本KUBOTA公司）,CO2孵箱（美国Thermo Forma公司）,倒置相差显微镜、万能荧光显微镜（日本Olympus公司）,PCR扩增仪（美国MJ Research INC公司）,核酸蛋白分析仪（美国Eppendorf BIO Photometer公司）。
　　1.3  方法
　　1.3.1  突变部位的选择  通过对比各物种CD59的氨基酸序列，发现W40位点是一高度保守位点，CD59的NMR结构显示其活性位点位于疏水性沟槽内，W40位于疏水沟槽中央[3]。因此，选择其为突变部位，其中第一个突变为W40的色氨酸缺失突变（m1CD59），第二个突变为C39W40K41突变为 W39W40W41的替换突变（m2CD59）。
　　1.3.2  引物设计  根据CD59 cDNA重组载体序列共设计1对常规上下游引物（pT7、T3），再分别合成1对反向互补寡核苷酸突变引物。突变m1CD59的突变引物（M1F、M1R）带有诱变位点，中部缺失TGG共３个碱基（TGG编码W40色氨酸），为W40的缺失突变。M2F、M2R为突变m2CD59的引物，中间部位有9个碱基的突变，是将TGTTGGAAG突变为TGGTGGTGG的替换突变。引物由上海生工公司合成。见表1。
　　表1  突变CD59基因引物设计（略）
　　1.3.3  目的基因的获得及纯化  以CD59 cDNA为模板，上述引物经重叠延伸PCR三重聚合酶链反应扩增获得目的基因。PCR1:引物为pT7、M1R,反应参数:94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s,42 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共25个循环；72 ℃延伸7 min。 PCR1扩增前半段CD59。PCR2:引物为M1F和T3,反应参数同PCR1。PCR2扩增后半段CD59,与PCR1产物有27碱基重叠（为引物部分扩增产物）。PCR3:将纯化的PCR1和PCR2扩增产物等摩尔混合为模板,pT7和T3为引物,94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s,46 ℃45 s,72 ℃ 45 s,共25个循环；72 ℃延伸7 min。扩增获得完整的含诱变位点的m1CD59目的基因片段。m2CD59的扩增条件相同，引物不同，PCR1的引物为pT7、M2R, PCR2的引物为M2F、T3, PCR3的引物为pT7和T3。10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。
　　
　　1.3.4  克隆载体构建  PMD18?T?Vector载体长2 692 bp,含有氨苄青霉素抗性基因，可与PCR扩增产物直接连接。扩增出的m1CD59、m2CD59经纯化后, 用T4DNA连接酶与PMD18?T?Vector载体16 ℃过夜连接,连接产物用CaCl2法转化JM109大肠杆菌,氨苄青霉素筛选。
　　1.3.5  阳性重组克隆的鉴定  PCR反应体系25 μL，其中含有转化重组质粒的E.coli JM109 菌液（模板）2 μL,10×buffer 2.5 μL,dNTP 0.2 mmol/L,Taq DNA 聚合酶 0.3 μL (1.5 U),以PT7和M1R (或M2R) 0.25 μmol/L 为引物，热启动变性94 ℃10 min,20循环(94 ℃ 30 s,45 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s),15循环(94 ℃ 30 s,46 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s), 72℃延伸7 min。将证实后的阳性克隆在LB培养基(含Amp)中大量扩增, 酚?氯?仿法小提PMD18?T?m1CD59?Vector、PMD18?T?m2CD59?Vector重组质粒。
　　1.3.6  表达载体pIRES的获取  真核表达载体pIRES长为6.1 kb,含有EcoR Ⅰ限制性酶切位点、氨苄青霉素和G418抗性基因。转化JM109大肠杆菌扩增并提纯。
　　1.3.7  表达载体构建和测序分析  EcoR Ⅰ 单酶切重组质粒PMD18?T?m1CD59?Vector、PMD18?T?m2CD59?Vector，回收并提纯带有黏性末端的m1CD59、m2CD59, 同时EcoR Ⅰ 单酶切pIRES真核表达质粒，带有黏性末端的pIRES应用碱性磷酸酶（CIAP）去磷酸化，T4DNA连接酶连接DNA与载体，16 ℃过夜，氯化钙法转化JM109大肠杆菌，氨苄青霉素筛选，阳性重组子pIRES?m1CD59和pIRES?m2CD59经PCR、限制性内切酶反应和DNA 测序等方法证实(由大连宝生物公司进行DNA序列分析)。 
　　2  结果
　　2.1  突变mCD59基因的克隆与鉴定
    
　　PCR1、PCR2扩增产物经10 g/L 琼脂糖凝胶电泳显示，扩增片段长约310、360 bp，PCR3扩增产物长约650 bp，见图1。将产物亚克隆入PMD18?T?Vector质粒多克隆位点，转化大肠杆菌JM109后，应用菌液直接进行PCR鉴定（图2），重组体用EcoR Ⅰ单酶切获得预期大小目的片段。经测序证实，诱变m1CD59克隆基因删除TGG（编码Trp40）而未产生其他突变，阅读框正确。m2CD59克隆基因TGTTGGAAG突变为TGGTGGTGG，无其他突变，阅读框正确。
　　2.2  重组表达载体构建与鉴定
    
　　EcoRⅠ单酶切PMD18?T?mCD59?Vector,胶回收试剂盒纯化回收获得m1CD59片段(500 bp)和m2CD59（500 bp），连接线性化及去磷酸化pIRES载体，重组载体经PCR（图3）、酶切并测序鉴定，证实pIRES?m1CD59和 pIRES?m2CD59两种真核表达质粒构建成功(图4、5)。

图1  突变CD59扩增结果（略）
    
　　1A： M为 DL2000 DNA Marker,①为 PCR1产物,②为PCR2产物,③PCR3产物m1CD59；1B：M为 DL2000 DNA Marker,①～③为PCR1产物,④～⑥为PCR2产物,1C：M为 DL2000 DNA Marker,①为PCR3产物m2CD59
　　图2  PMD18?T?mCD59重组体转化JM109菌液PCR鉴定结果（略）
    
　　M为DL2000 DNA Marker,①、④、⑥、⑦、⑨、⑩为阳性重组体PCR产物,②、③、⑤、⑧为阴性结果
　　图3  重组pIRES?mCD59PCR鉴定结果（略）
    
　　M为DL2000 DNA Marker,②、⑤、⑥、⑧为阳性克隆PCR产物,①、③、④、⑦为阴性克隆
　　图4  真核表达重组质粒鉴定结果（略）
    
　　M为DL2000 DNA Marker;4A:①、③为pIRES?m1CD59质粒，②、④为EcoRⅠ内切酶酶切pIRES?m1CD59产生条带;4B:①、③为 EcoRⅠ内切酶酶切 pIRES?m2CD59产生条带，②为重组体EcoRⅠ酶切阴性结果
　　图5  序列测定结果（略） 
  
　　5A为WTCD59序列，5B为m1CD59序列， 5C为 m2CD59序列
　　3  讨论
    
　　基因工程定点突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一，可以有目的地改变DNA序列中的碱基。它不仅可以阐明基因表达的调控机制，还可用于研究蛋白质结构与功能之间的关系。自从PCR技术发明以来,便被用于进行定点突变[6]。本研究为了获得定点突变，应用重叠延伸PCR法重构CD59基因。重叠延伸PCR技术由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有广泛而独特的应用[7]。重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计，本实验应用Primer Premier软件设计引物，突变碱基设计在引物的中间部位，突变引物设计合理，三重PCR扩增产物，测序证实成功地扩增出两种CD59新型突变，说明应用重叠延伸PCR法诱变经济可靠。
    
　　另外，在阳性克隆PCR鉴定时，我们尝试应用两种退火温度20+15个循环，用菌液直接鉴定，减少提取质粒的工作量，减少摸索退火温度的时间。通过反复试验，我们确定取2 μL菌液为模板，直接放入PCR扩增仪中94 ℃ 8～10 min，完全可使菌体崩解，使DNA释放。应用含有重组质粒的菌液做模板，鉴定效果良好。  
    
　　近年来研究显示,肿瘤细胞表面CD59分子过表达，提示与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关，而且肿瘤抗体治疗效果不佳的原因是由于存在包括CD59在内的膜补体调节蛋白，抑制抗体依赖性补体的杀伤作用。因此，明确CD59分子与补体的结合部位，设计封闭CD59活性位点的多肽分子，可提高肿瘤细胞的抗体诱导补体溶解的敏感性。本实验选取CD59物种间高度保守的W40位点及邻近氨基酸，应用点突变技术，成功地构建两种新型突变并重组入真核表达载体pIRES,下一步转染真核细胞如CHO细胞或Hela细胞，检验突变蛋白表达情况及生物学功能的变化，研究W40位点在CD59分子中的作用，确定CD59的保护性活性位点的所在位置。从而进一步结合噬菌体肽库技术，设计短肽封条封闭CD59的活性位点，阻止CD59的抗补体作用，提高补体对肿瘤的杀伤效应，为肿瘤的免疫治疗提供理论依据。
【参考文献】
  　　[1]NINOMIYA H, STEWART B H, ROLLINS S A, et al. Contribution of the N?linked carbohydrate of erythrocyte antigen CD59 to its complement?inhibitory activity[J]. J Biol Chem, 1992,267:8404.
　　[2]FARKAS I, BARANYI L, LSHIKAWA Y, et al. CD59 blocks not only the insertion of C9 into MAC but inhibits ion channel formation by homologous C5b?8 as well as C5b?9[J]. J Physiol, 2002,39(2):537.

　　[3]YU J, ABAGYAN R, DONG S, et al. Mapping the active Site of CD59[J]. J Exp Med, 1997,185(4):745.

　　[4]BJORGE L, STOIBER H, DIERICH M P, et al. Minimal residual disease in ovarian cancer as a target for complement?mediated mAb immunotherapy[J]. Scand J Immuno, 2006,63(5):355. 

　　[5]HUANG Y, QIAO F, ABAGYAN R, et al. Defining the CD59?C9 Binding Interaction[J]. J Biol Chem, 2006,281(37): 27398.

　　[6]罗师平,冷希岗. 基于PCR的体外诱变技术[J]. 国外医学:生物医学工程分册, 2005,28(3):188.

　　[7]徐芳,姚泉洪,熊爱生,等. 重叠延伸PCR技术及其在基因工程上的应用[J]. 分子植物育种, 2006,4(5):747.