转基因大豆植株数字PCR在分析中的应用

1。介绍

如今，转基因作物通常在美国种植。根据

从美国农业部最近的报告，基因

种植作物（主要是玉米，棉花和大豆）种植约

2013美国土地一半用于农作物

（HTTP：/ / www.ers。农业部政府/媒体/ 1282246 / err162 .pdf）。其他国家，如中国

和巴西，正在迅速赶上采用和种植转基因作物

为工程性状的好处，如除草剂耐受性和抗虫性。

不过，公众仍然非常关注基因的潜在风险

改性生物（转基因生物）对人类，动物和环境[ 1 ] - [ 6 ]。

一些国家已经采取严格的法规来控制转基因生物，例如，

欧洲联盟（欧盟）。检测和量化的转基因生物是必要的

执行这些规定。目前，各种DNA聚合酶链反应

PCR（PCR）方法通常用于检测和/或量化转基因

转基因生物由于其敏感性，例如，定期终点PCR和实时定量

PCR（qPCR）方法，尤其是后者[ 5 ] [ 7 ] - [ 16 ]。偶尔，其他方法，

如生物传感器和免疫测定，也用于分析转基因生物[ 5 ] [ 7 ]—

[ 13 ]。此外，一些新技术，如新一代测序和

数字PCR（dPCR），也被用在分析转基因生物，例如，[ 15 ] [ 17 ] [ 18 ]

[ 19 ] [ 20 ] [ 21 ]。

采用反应是基于以下原则：一是充分的DNA模板

随后稀释成许多独立的小等体积反应

（在威尔斯或液滴中）。以及这些反应中模板分子的数目

服从泊松分布。因此，绝对量化可以通过以下方式实现

比较正面和负面的反应[ 14 ] [ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]。因此，检测

具有以下在qPCR的潜在优势。检测可以准确

在未经认证的参考下确定样品中核酸分子的数目

材料和标准曲线；一个模板也相应稀释稀释

可能出现在模板使检测抑制剂不敏感的抑制剂

[ 27 ] [ 28 ]，因此进一步提高精度和效率。这些属性

和很多的应用优势使得检测灵敏度或一个很好的工具

需要精确的核酸定量，如识别突变或拷贝

肿瘤细胞的数量变化，低拷贝核酸靶的检测，或

检查基因表达在单细胞水平[ 26 ] [ 29 ] [ 30 ] [ 31 ] ]。这样的特性

数字PCR也应该是有用的分析转基因生物。多项研究已

已经报道了使用数字PCR分析转基因生物，例如，[ 17 ] [ 18 ] [ 20 ] [ 21 ]

[ 28 ] [ 30 ] [ 32 ] [ 33 ] [ 34 ]。

目前，一些数字PCR系统可从以下公司：

Bio-Rad实验室飞雨，和基于一个技术[滴]，和Fluidigm

公司与赛默飞世尔科技Applied Biosystems（芯片）

[ 25 ] [ 35 ] [ 36 ]。发布由赛默飞世尔科技™应用数字PCR系统

生物六月，2013被称为quantstudio3D数字PCR系统

J. R. Wan等。

四百零五

3.2。设计了具体的检测和荧光定量检测

量化RR1和RR2大豆使用检测

为了检测特异性检测事件特异性RR大豆，设计

荧光定量检测法分析两RR1和RR2大豆，连同

传统的非转基因大豆（杰克），以检测控制。为此目的，

使用完整的DNA，这是孤立的，通过董事会制定的方法

卫生与消费者保护生物技术研究所联合研究中心

与转基因生物单元

（HTTP：/ /转基因CRL。JRC。EC。欧罗巴。欧盟/总结/ a2704-12_soybean_dnaextr_report .pdf），

本研究中所谓的传统方法。在第一次实验中，

分别进行靶基因和参考基因反应。平等

量（40 ng）从RR1基因组DNA，RR2和杰克大豆作为

在每个反应的模板，使终浓度为2纳克/毫升（µL）的

基因组DNA。TaqMan PCR反应后，芯片进行芯片扫描

读者，并将获得的数据进行quantstudio™3d analysissuite™分析

云软件（http：/ /应用。赛默。COM / quantstudio3d /）。

通过数据分析，对目标[ RR1和RR2转基因]或引用的副本

得到了各反应每µL基因（表2）：1198，1403.3，和1416份/µL

外源凝集素基因的；0.5，1443.7，和0.948份/µL的RR1转基因；0.4，0.4，-数字PCR系统。该系统允许多达20000个反应，以并行运行

在一个单一的，封闭的芯片。整个系统包括一个热循环仪，一

自动芯片装载机和芯片阅读器，结构紧凑，可以很容易地安装在实验室

台。该系统是负担得起的（低于50000美元）。该系统易于使用和允许

核酸的绝对定量（如每µl核酸的复制）。因为

芯片是封闭的，可以避免潜在的交叉污染。此外，多

芯片可以结合起来，实现必要的分区和/或量化的DNA

样品中的目标（https：／／应用程序。赛默。COM / quantstudio3d /）。测试它的有用性

在分析转基因生物，转基因大豆称为农达准备就绪（RR）1和2

由孟山都公司开发了利用该quantstudio™3D分析

数字PCR系统。

许多研究已经对RR1大豆进行的，主要利用基于PCR的

方法检测和/或量化的转基因，例如，[ 37 ] - [ 44 ]。最近，检测和

使用数字PCR定量的方法也有报道[ 34 ]。在本研究中，

在定量的工作室3D数字PCR系统在分析RR1的适用性

和RR2大豆研究。qPCR也被纳入研究的比较。

在这项研究中，的RR1和RR2大豆事件特异TaqMan分析设计

并表明它们在检测转基因事件时具有特异性。低

1%的RR1和RR2大豆材料可以可靠地检测和量化

使用鸭1482.5拷贝/ L的转基因是detected RR2的杰克，RR1和RR2

的反应，分别。由于只读副本的0.948 RR1转基因的大豆RR2

0.4和RR2拷贝的转基因的大豆RR1，和0.5的只读副本

转基因拷贝RR1和RR2的0.4的非转基因大豆transgenic杰克

在自行设计的实验detected，RR1和RR2的特异性soybeans甚是这样

for each of the双transgenic事件。

notably的副本，每一个RR转基因µ是非常靠近那些同行参考

凝集素基因在相同的RR大豆样品：有各种1443.7 RR1的副本

转基因的拷贝和1403.3参考凝集素基因在每微升的RR1 PCR

反应和1482.5拷贝的转基因拷贝和RR2 1416凝集素的参考

基因在每个µRR2的PCR反应。NO是detected RR转基因的野生

杰克的大豆。因此，两个荧光分析检测工作的很好

和《quantifying RR RR转基因的soybeans在dpcr平台。

DNA的浓度在反应混合物作为抵抗的原始DNA的股份可以

很容易被calculated使用这些数据。因为在大豆基因组（haploid size is 1.1）