针刺联合紫杉醇对小鼠Lewis肺癌细胞凋亡相关因子p53、bcl-2蛋白表达的影响

 1 实验材料

1.1  动物    C57BL/6小鼠54只,雌雄各半,体重(20±2)g,京维通利华实验动物有限责任公司提供,合格证号：007250639,动物等级：SPF级。　1.2  试剂及药物    Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞株(中国医科大学免疫学教研室)；紫杉醇注射液(四川升和制药有限公司,浓度为30 mg/5 mL,批号050401)；兔抗p53、Bcl-2一抗(北京中杉生物公司)；碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG(北京中杉生物公司)；甘氨酸(GIBCO公司)；过硫酸铵(Promega 公司)；牛血清白蛋白(BSA,北京元亨圣马生物技术研究所)；酚试剂(Sigma公司)；硝酸纤维素膜(Immobilon-NC Transter Membranes MILLPORE), O-dianidine, 25 mg β-naphthyl acid phosphate (Sigma公司)。

2  实验方法

2.1  造模    Lewis肺癌小鼠肿瘤细胞株从冻存的液氮内取出,37 ℃水浴复苏后分别接种于6只C57BL/6小鼠左后肢皮下,待瘤体长至1.0～1.5 cm时,处死小鼠；选择生长良好的瘤组织,无菌取出,剪碎,研磨,过滤,制成单细胞悬液；台盼蓝染色观察记录活细胞数(>90%),调整细胞浓度至活瘤细胞计数约1×107个/mL瘤细胞,给每只实验组小鼠左后肢内侧皮下接种0.2 mL(约含活细胞2×106个),即为荷瘤模型。

　　2.2  分组

    接种后将动物均匀随机分为4组,每组12只,雌雄各半,即肺癌模型组(模型组)、肺癌＋针刺“肺俞”组(针刺组)、肺癌＋紫杉醇注射液组(药物组)、肺癌＋紫杉醇＋针刺“肺俞”组(针药结合组)。   电子商务论文发表

　　2.3  紫杉醇注射液的制备

    取紫杉醇溶液30 mg/5 mL,加生理盐水25 mL,制成1 mg/mL的紫杉醇注射液。

　　2.4  处理因素

    接种后第5天开始治疗,连续治疗10 d。模型组：固定,每日每只腹腔注射等量生理盐水；针刺组：固定,针刺“肺俞”穴,每日1次；药物组：固定,每日每只腹腔注射紫杉醇注射液10 mg/kg；针药结合组：固定,针刺“肺俞”穴,20 min后腹腔注射紫杉醇注射液10 mg/kg,每日1次。针刺方法：顺经脉走行斜刺皮下约0.2 mm,用均匀手法小幅度捻转1 min,留针15 min,间歇行针两次(按照中国针灸学会学术部提供的大鼠穴位解剖图谱及比较解剖学取穴)。

　　2.5  取材

    接种后第15天断颈处死动物,完整仔细地剥离肿瘤结节待测。

　　3  观察指标

　　3.1  小鼠生存状态

    接种后第5天起,每组动物每日称重,观察动物进食、活动状态及死亡情况,并记录。

　　3.2  肿瘤体积的动态变化

    接种后第5天起,每日用游标卡尺(精度为0.1 mm)测定肿瘤的最长径a和最短径b,按公式V=ab2/2(V为肿瘤体积,a为肿瘤长径,b为肿瘤短径)计算肿瘤体积,统计得出各组肿瘤平均体积,并绘制出生长曲线。

　　3.3  细胞凋亡相关因子p53和Bcl-2蛋白表达的检测   电子商务论文发表

　　3.3.1  总蛋白的提取

　　将肿瘤组织块碾成粉末,加入已预冷的裂解液中, 在冰浴中用匀浆机匀浆2 min,14 000×g,4 ℃离心1 h,取上清于4 ℃存放备用。
3.3.2  蛋白定量

　　用酚试剂法进行蛋白定量。将样品及另一种标准蛋白质(牛血清白蛋白)各取50 μL,用双蒸水按1∶10稀释(50 μL加450 μL水),所有各管均加4 mL碱性铜试剂,充分混合,放置20 min,加0.5 mL 1 mol/L酚试剂,立即混匀,50 ℃水浴10 min,用紫外分光光度计测样品光密度数值,空白管以蒸馏水调零,记录所测样品光密度数值,计算出蛋白浓度。

　　3.3.3  浓度的调整与样品的处理

　　把样品调成相同浓度,加入样品buffer,沸水煮5 min。

　　3.3.4  SDS-PAGE电泳

　　配制12%聚丙烯酰胺的分离胶和4%聚丙烯酰胺的浓缩胶；灌制胶板。上样量为50 μg,120 V继续电泳1.5 h,结束电泳,取出凝胶。

　　3.3.5  蛋白质的电转印及膜的封闭

　　电泳结束后,根据标准蛋白的位置,确定待测蛋白的所在区域,切割硝酸纤维膜。将电泳凝胶与硝酸纤维素膜贴在一起,排出气泡,置膜在正极、凝胶在负极,用湿式转印电泳槽转印,50 V,100 mA,2 h。转印结束后,将膜置入TBS缓冲液中浸泡10 min,用含5%脱脂奶粉TBS封闭液封闭后,室温过夜。

　　3.3.6  蛋白质印迹和化学发光显色   电子商务论文发表

　　次日,取出硝酸纤维素膜,用TTBS缓冲液洗2次,每次5 min,然后加入兔抗p53、Bcl-2多克隆抗体(1∶400)孵育4 h,用TTBS缓冲液洗2次,每次5 min,然后加入碱性磷酸酶偶联的羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育2 h,用TBS洗2次,每次5 min,再用TTBS缓冲液洗2次,每次5 min,然后加入O–dianidine,β-naphthyl acid phosphate 显色至条带清晰为止。

　　3.3.7  图像分析

　　采用自动电泳凝胶成像分析仪(Chmi Imager 5500,USA)进行图像扫描,并对条带进行密度分析,比较各组p53和 Bcl-2蛋白质表达水平。

　　4  结果

　　4.1  生存状态

    模型组实验后第10天有1只动物死亡,药物组用药后5、8 d分别有1只动物死亡；针药结合组用药后7 d有1只动物死亡。药物组整体生长状态不良,进食及活动不佳,小鼠比其他组明显消瘦,说明紫杉醇有一定的毒副作用；但针药结合组小鼠的生长状态明显优于单纯用药组,针刺组的带瘤生存状态最佳。说明针刺有改善小鼠生存状态的作用,针药结合在改善小鼠生存状态方面有协同作用。

　　4.2  肿瘤体积的动态变化和生长曲线(见图1)
 
　　4.3  p53、Bcl-2蛋白表达(见图2)

　　5  讨论  电子商务论文发表

    研究表明,肿瘤不仅是增殖和分化异常的疾病,也是细胞凋亡异常的疾病,细胞凋亡状态及其调控基因异常可导致细胞生态平衡率紊乱,参与肿瘤的发生发展[1]。调控基因大体分为凋亡促进基因和凋亡抑制基因,在众多调控基因中,p53和Bcl-2与肺癌的发生发展及预后密切相关。

　　本研究发现：4组肿瘤细胞中均有mtp53、Bcl-2蛋白表达,说明两种基因蛋白表达均与肺癌关系密切,mtp53和Bcl-2均为凋亡抑制基因,故mtp53和Bcl-2蛋白表达减少具有正向促进肿瘤细胞凋亡的作用,而且肿瘤细胞凋亡率与p53和Bcl-2密切相关。针刺组、药物组、针药结合组p53、Bcl-2蛋白表达均较模型组显著降低；针药结合组与单纯针刺组和单纯药物组比较也有显著降低。说明针刺和药物均能从分子水平对p53和Bcl-2起调节作用,但以针药结合疗效更为显著,说明针刺与紫杉醇合用在对基因的调控上产生了叠加效应。提示针刺与紫杉醇联合抗肿瘤的协同增效作用,同时也说明针药结合可联合抑制p53突变,降低Bcl-2蛋白表达,从而促进肿瘤细胞凋亡,这是实现抗肿瘤的主要机制之一。