基质金属蛋白酶-2 基因在宫颈癌组织中的表达及意义

【摘要】目的：研究MMP- 2在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达，并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较，探讨其与宫颈癌侵袭/转移的关系。方法：应用RT-PCR的方法检测48例宫颈癌组织、正常宫颈组织及16例宫颈良性病变组织中MMP-2 的表达情况，并对数据进行分析。结果：MMP-2在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达率分别为64.58%、37.50%、31.25%，宫颈癌与正常宫颈组织（P=0. 012）、宫颈癌与宫颈良性病变组织（P=0. 031）间的MMP-2表达率差异有统计学意义，而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的MMP-2表达率差异无统计学意义（P=0.091）。MMP-2在不同临床分（P=0.001）及淋巴结转移（P=0.002）中的表达率存在显著差异，但在不同年龄患者的癌组织中MMP-2的表达率无差异（P>0.05）。结论：MMP-2在宫颈癌中的表达率明显高于正常宫颈组织及宫颈良性病变组织MMP-2与宫颈癌临床分期密切相关，临床分期越晚，其肿瘤组织中MMP - 2的表达率越高。伴淋巴结转移宫颈癌MMP - 2表达率高于无淋巴结转移者。MMP-2表达率与患者年龄无关。 医学职称论文发表 医学论文发表网 医药论文发表 医学论文发表网站 医学论文发表期刊
【关键词】宫颈癌，机制金属蛋白酶－2 ，逆转录聚合酶链式反应
【Abstract】Objective:To study the expression of MMP-2 in human cervical cancer and explore the relationship between MMP-2expression and clinicalpathological feature（s patient’s age,limph node metastasis,clinical stage,）. Method：The expression of MMP-2 in 48 cases of human cervical cancer tissues,normal cervical tissues and 16 cases of cervical benign lesion tissues was detected by reverse transcriptase polymerase chainreaction (RT-PCR).Results: Theexpression rate of MMP-2 in cervical cancer，normal cervical tissues and cervical benign lesion tissue were 64.58%、37.50%、31.25%,statistical difference wasfound among cervical carcinoma group,normal cervical tissues group and benign lesion group.The expression of MMP-2were associated with clinical stage (P=0.001) and lymph node metastasis (P=0.002),but had no correlation with age and tumor size (P>0.05).Conclusion:MMP-2expression is increased in cervical cancertumor tissues compared with normal tissues and cervical benign lesion tissue,MMP-2 is relevant with the occurrence of cervical cancer.The cervical cancer cellsproliferation capacity is increase,degree of malignancy is higher and facilitates metastasis occurred which MMP-2 expressed.
【Key words】Cervical cancer,MMP-2,RT-PCR
         基质金属蛋白酶家族(MMPs)是一类活性依赖金属锌离子的蛋白酶,可以有效地降解基底膜和细胞外基质(ECM),从而参与促进肿瘤生长、浸润和转移[1]。基质金属蛋白酶-2(MMP-2)是MMPs家族的重要一员,在多种肿瘤中存在过表达,对肿瘤的侵袭和转移起重要作用。本研究对MMP-2在宫颈癌组织、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达进行检测，并与宫颈癌患者年龄、淋巴结转移与否、临床分期进行比较，探讨其与宫颈癌侵袭转移的关系。
         1　材料与方法　
         1.1　标本来源　标本均来自我院2006年10月～2009年10月期间住院手术切除标本共112例。其中宫颈良性病变组织16例（宫颈糜烂10例、宫颈息肉3例、宫颈肥大3例）、宫颈癌组织（病理证实为鳞状细胞浸润癌及宫颈腺癌）及正常宫颈组织（因子宫肌瘤行子宫全切患者）各48例。病理分级根据2006年修订的国际妇产科联盟（FIGO）宫颈癌分期，0期5例，Ⅰ期28例，II12例，Ⅲ期3例；伴淋巴结转移30例，无淋巴结转移18例；全部患者术前均未行任何抗癌治疗。所有患者均为女性，宫颈癌患者中位年龄48岁（18～77岁）；宫颈良性病变患者中位年龄34岁（22～43岁）。
         1.2　组织总RNA的提取和cDNA的合成　总RNA的提取参照TRIzol试剂说明书操作,所得RNA用75%乙醇洗涤后晾干,溶于20ml DEPC水中,再经微量核苷酸定量检测仪测定RNA浓度及A 2 6 0 /A 2 8 0, 琼脂糖凝胶电泳检测R NA质量,选取A260/A280比值为1.8-2.0的RNA进行反转,所得的cDNA产物在-20℃保存,用于下一步PCR。
         1.3　逆转录反应　在20μl的反应体系中加入5×reactionbuffer4μl，olig（o dT）18Prime（r 0.5μg/μl）1μl，RiboLock TMRibonuclease inhibitor（20U/μl）1μl，10mM dNTP 2μl，总RNA2μg，逆转录酶M-MLV1μl，DEPC水补齐至20μl，42℃孵育60min（逆转录），72℃孵育10min以终止反应，于冰上降温（灭活逆转录酶）。
         1.4　PCR反应　扩增MMP-2基因的引物序列，上游引物ACTTTGGCCGCTGGGAGCAT，下游引物：GGCGCTGGTGCAGCTCTCAT，扩增产物长度410bp，β-actin为内参照，上引物：CAACTTCATCCACGTTCACC，下游引物：GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，扩增产物长度268bp。25μl的反应体中加入cDNA2μl，LOX上、下游引物各1μl，PCR Master Mx12.5μl，去离子水8.5μl混匀后，置于PCR仪中，反应条件：95℃预变性10min后，95℃30s，61℃30s，72℃30s，40个循环，最后72℃延伸10min。
         1.5　PCR产物鉴定　用1.0%琼脂糖凝胶将提取的RNA进行电泳，在紫外线灯下观察。
         1.6　统计分析　计数资料采用2检验及四表格确切概率法，采用SPSS 13.0软件进行统计学处理。
         2　结果
         2.1　MMP-2在宫颈癌、正常宫颈组织及宫颈良性病变组织中的表达MMP-2在宫颈癌组织中的表达率为64.58%，而在正常宫颈组织和宫颈良性病变组织中的表达率分别为37.50%、31.25%。统计学分析，宫颈癌与正常宫颈组织（P=0.012）、宫颈癌与宫颈良性病变组织（P=0.031）间的MMP-2表达率差异有统计学意义，而正常宫颈组织与宫颈良性病变组织之间的MMP-2表达率差异无统计学意义（P=0.091）。见表1。 2.2　MMP-2与临床病理特征的关系0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期宫颈癌MMP-2表达率分别为40.00%、39.29%、100.00%、100.00%，统计学分析，Ⅱ、Ⅲ期宫颈癌MMP-2的表达率明显高于0、Ⅰ期（P=0.001）；伴淋巴结转移宫颈癌MMP-2表达率为80.00%，明显于无淋巴结转移的33.33%（P=0.002）；在18～50岁、>50岁的患者中MMP-2的表达率分别为60.60%、73.33%，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

         3　讨论
         宫颈癌侵袭转移是其重要的生物学行为,是导致患者死亡的主要原因。肿瘤的转移和浸润都需要降解其周围的基质和基底膜[2],使肿瘤细胞能够有更多的活动空间及进入周围组织的通道。肿瘤周围的细胞外基质和基底膜的主要成分为Ⅳ型胶原和明胶,是金属基质蛋白酶的主要作用底物,至今[3],已经有20多种不同的MMPs被克隆,其中MMP-2是其中作用较强的一种,也被认为是与肿瘤关系最为密的一种。MMP-2在体内以72-kDa的非活化形式分泌,在膜型金属基质蛋白酶(MTI-MMP)的作用下转化为67-kDa的活化形式,降解Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白和层粘蛋白[4]。MMP-2几乎对细胞外所有的基质成分都有一定的降解作用。大量研究表明,在多种恶性肿瘤组织中存在MMP-2的过度表达。YOSHINO等[5]研究结果显示,黑色素瘤病人血清中MMP-2的含量高于正常对照组。LANGENSKIOLD等[6]研究结果显示,直肠癌病人血浆MMP-1、MMP-2、MMP-9蛋白表达均升高,认为血浆MMP-2水平可作为肿瘤恶性程度的一个相关指标。HPV是宫颈癌发生的重要病因,SMOLAHESS等[7]发现HPV阳性宫颈癌细胞系中有MTI-MMP的表达,过度表达的MTIMMP通过活化MMP-2与宫颈癌细胞的侵袭性高度相关。在本研究中，MMP-2在正常宫颈组织及宫颈良性病变组织的表达率分别为37.50%、31.25%，且差异均无统计学意义，提示MMP-2在宫颈良性病变的发生中作用并不十分明显。而在宫颈癌中MMP-2高达64.58%，高于正常宫颈组织及良性病变组织，表明MMP-2的过度表达与宫颈癌的发生有关。HIF-1在不同临床分期患者中的表达不完全相同，Ⅱ期、Ⅲ期宫颈癌患者癌组织中的表达率较0期、Ⅰ期患者升高。该实验结果反映出MMP-2表达的变化趋势，即随着宫颈癌病情的进展，MMP-2的表达率呈上升趋势。在伴有淋巴结转移的患者中MMP-2的表达率明显高于无淋巴结转移患者，提示MMP-2可能与宫颈癌发生淋巴结转移有关。而MMP-2在不同年龄组的宫颈癌患者中的表达率在统计学上无显著差异（P>0.05），表明MMP-2与患者年龄无关。以上研究表明MMP-2与宫颈癌的生存率有关。MMP-2高表达者TNM分期晚,分化低,并易出现淋巴结转移,提示MMP-2可以作为判断宫颈癌恶性类型的有用指标。MMP-2表达率与患者年龄无关。
参考文献
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[2] Takahashi E,Tateyama H,Akatsu H,et al.Expressionof matrix metalloproteinases 2 and 7 in tumorcells correlates with the World Health Organizationclassification subtype and clinical stage ofthymic epithelial tumors[J].HumPathol,2003,34(12):1253-1256.
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[4] I t o h Y , I t o N, N a g a s e H , e t a l .C e l l s u rf a c ecollagenolysis requires homodimerization of themembrane-bound collagenase MT1-MMP[J].Mol BiolCell, 2006,17(12):5390-5397.
[5] YOSHIO Y,KAGESHITA T,NAKAJIMA M,et al. Clinicalr e l e v a n c e o f s e r u m l e v e l s o f m a t r i xmetalloproteinase-2,and tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1 and-2 in patientswith malignantmelanoma[J].Dermatol,2008,35(4):206-214.
[6] LANGENSKIOLD M,HOLMDAHI L,FALK P,et al. Increasedplasma MMP-2 protein expression in lymph nodepositivepatients with colorectal cancer[J].Int JColorectal Dis,2005,20(3):245-252.
[7] SMOLA-HESS S,PAHNE J,MAUCH C,et al. Expression ofmembrane type 1 matrix metalloproteinase inpapillomavirus-positive cells:roles of the humanpapillomavirus(HPV)16 and HPV8 E7 gene products[J].J Gen Virol,2005,86(5):1291-1296.