基于脾虚证相关基因功能鉴定的小肠上皮细胞RNA干扰转染条件研究

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是真核生物中普遍存在的一种自然现象，是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)启动序列特异的转录后基因沉默过程，是生物体在进化中形成的一种内在基因表达的调控机制。Fire等[1]首次在线虫中发现RNAi现象，后来大量的研究表明，RNAi广泛存在于真菌、植物和动物中，由此人们认识到RNAi技术作为研究基因功能的一种有力的革命性工具，在功能基因组、转基因动物研究、基因治疗、药物开发等方面有着巨大的潜力[2-3]。目前RNA干扰技术在国内外已成为研究基因功能最常用的技术之一。

　　影响RNA干扰效率的主要因素是小型干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的序列及转染效率，而控制不同的干扰效率可建立模拟靶蛋白不同表达水平的细胞模型。因此，对转染条件的控制有利于获得对目的蛋白表达不同干扰程度的细胞模型。而影响转染效率的关键是转染试剂和siRNA的比例，但不同种类的细胞该比例是不同的。小肠上皮细胞?6(IEC?6)细胞株是Quaroni等[4]研究建立的，其来源于新生的正常大鼠小肠，在组织学和免疫学方面具有隐窝样上皮细胞的特征，为未分化的上皮干细胞，无特异性基因表达及无致瘤性。目前将RNAi技术应用到肠上皮细胞的研究国内较少报道。本实验室近年来以IEC?6细胞株用于消化系统疾病的体外相关研究[5-7]。为在该细胞上开展RNAi的脾气虚证相关基因的功能研究，本实验采用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染效率的方法，优化阳离子脂质体转染siRNA进入IEC?6细胞的条件，为后续实验提供参考。现报道如下。

　　1材料与方法教育教学论文发表

　　1?1细胞株IEC?6细胞株(CRL?1592)购自The American Type Culture Collection(ATCC)，LOT：4785615。

　　1?2主要试剂与仪器Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、Fetal Bovine Serum(FBS)均为GIBCO公司产品，胰酶Trypsin(1∶250)为Amresco产品，乙二胺四乙酸二钠(EDTA2Na·2H2O，分子量372?24)由广州威佳科技有限公司提供，Albumin及Bovine为Genebase产品，牛胰岛素(insulin)为Sigma产品，Ncontrol?05815?FAM(No.2005815122174)购自广州市瑞博生物科技有限公司，转染试剂LipofectamineTM2000(Cat.No.11668?027)、Opti?MEM(Cat.No.31985?062)均由Invitrogen公司提供。IX?71型相差荧光倒置显微镜为Olypums公司产品，ALTRA EPICS型流式细胞仪为贝克曼尔特实验系统(苏州)有限公司广州分公司产品。

　　1?3细胞培养取液氮保存的IEC?6细胞37℃水浴使其迅速融化后，将冻存液转移至离心管内，3000 r/min离心5 min，去上清液，加入2 mL DMEM完全培养液(体积分数90%DMEM+体积分数10%胎牛血清+4 mmol/L L?谷氨酰氨+0?1 U/mL牛胰岛素+10 mmol/L HEPES)重新悬浮沉淀的细胞，接种于培养瓶，体积分数10%CO2、90%空气，饱和湿度下37°C培养，次日换液。至80%左右融合时，用2?5 g/L胰酶?0?53 mmol/L EDTA消化传代。

　　1?4种植细胞待培养瓶内IEC?6细胞生长至80%~90%时，胰酶消化细胞，制作单细胞混悬液，按1×105 cells/mL，每孔1 mL密度种植到24孔培养板上，以保证第2天生长至60%。

　　1?5转染siRNA片段以定量的Opti?MEM稀释Lipofectamine 2000，用加样枪轻轻混匀后，室温下孵育5 min(a液)。用定量的Opti?MEM稀释FAM?siRNA，用加样枪轻轻混匀(b液)。将a液与b液充分混匀，室温下孵育20 min(c液)。将c液加到合适的细胞培养板中，另外每孔加入0?5 mL不含血清的培养基，轻轻摇晃培养板以混匀，然后在37 ℃、体积分数10%CO2条件下孵育细胞，5 h后更换为含体积分数10%血清的完全培养基，再放回培养箱继续培养。

　　1?6荧光显微镜检测转染效率设置FAM?siRNA(A)0、40、80、160 nmol/L组，同时Lipofectamine 2000(B)设0、1?0、1?5、2?0 μL剂量，每组3个复孔，共48孔。转染12 h后荧光倒置显微镜下成像，每孔选择3个视野，每个视野分别于明场和荧光条件下成像1张，每孔选择1张荧光表达强度最强的照片进行评分[8]。0分：几乎或完全没有荧光。1分：有微弱荧光表达且表达不密集。3分：荧光表达强烈且密集。2分：介于1分和3分之间，有较强荧光表达但不集中或者有微弱荧光表达但较密集(图1，见彩图页第616页)。经9人次评分后计算平均分值并作数据统计，进行秩和检验。教育教学论文发表

　　1?7流式细胞仪检测转染效率根据荧光显微镜成像评分结果设置不同组别，每组3个复孔。24 h内磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞2次，每孔加入0?5 mL消化液，孵育2 min后，加入等量完全培养基终止消化，混匀，离心，弃上清，PBS重悬，计数，调整细胞至同一密度，在激发波488 nm，发射波525 nm上机检测。

　　1?8统计学方法采用SPSS 11?0统计软件对荧光显微镜检测荧光强度数据进行多样本等级资料统计分析(Kruskal Wallis H)。

　　2结果

　　2?1细胞培养IEC?6细胞接种后次日开始缓慢生长，之后生长速度急剧加快。若按1∶3分瓶传代，一般5 d后即可达80%融合。图2可见IEC?6细胞由均匀的上皮样细胞群组成，呈铺路石镶嵌排列，互不重叠，呈现典型的单层形态。细胞为不规则多角形，边界清楚。细胞核较大，呈卵圆形，细胞间互相连接，呈现旺盛的增殖活性。

　　图2相差倒置显微镜下IEC?6细胞形态

　　Figure 2Histological features of IEC?6 under phase

　　contrast inverted microscope2?2荧光显微镜检测转染效率评分后，若仅有转染试剂或仅有FAM?siRNA，或两者均无的组别评分均为0。而转染试剂加FAM?siRNA组别均有或强或弱的荧光表达，其中荧光表达强度最弱的是Lipofectamine 2000 1?0 μL+ FAM?siRNA 40 nmol/L和Lipofectamine 2000 2?0 μL+FAM?siRNA 40 nmol/L。在FAM?siRNA 160 nmol/L不变、转染试剂改变(1?0、1?5、2?0 μL)时，3组荧光表达强度比较，差异无显著性意义(P>0?05)。在FAM?siRNA 80 nmol/L不变、转染试剂改变(1?0、1?5、2?0 μL)时，3组荧光表达强度比较，差异无显著性意义(P>0?05)。在FAM?siRNA 40 nmol/L不变、转染试剂改变(1?0、1?5、2?0 μL)时，3组荧光表达强度比较，差异无显著性意义(P>0?05)。在转染试剂1?0 μL不变、FAM?siRNA改变(40、80、160 nmol/L)的情况下，3组荧光表达强度比较，以80 nmol/L组表达较强，差异有显著性意义(P<0?05)。在转染试剂1?5 μL不变、FAM?siRNA改变(40、80、160 nmol/L)时，3组荧光表达强度比较，差异无显著性意义(P>0?05)。在转染试剂2?0 μL不变、FAM?siRNA改变(40、80、160 nmol/L)时，3组荧光表达强度比较，以80 nmol/L和160 nmol/L组表达较强，差异有显著性意义(P<0?05)。结果见表1。教育教学论文发表

　　2?3流式细胞仪检测转染效率结果见图3和表2。在无FAM?siRNA时，只有1%左右的表达率(图3-a)。转染试剂在1?0 μL 时，表达效率要高于1?5 μL (图3-b、c、d、e)，尤以Lipofectamine 2000 1?0 μL+ FAM?siRNA 160 nmol/L组最高(图3-e)，平均达到76?3%。表1各组荧光强度评分平均秩和值　表2流式细胞仪检测各组转染效率

　　3讨论

　　本课题组前期收集了慢性胃炎脾气虚证患者及健康志愿者各4例，镜下取胃黏膜组织，提取总RNA，一一配对制作基因芯片，采用荧光比值、生物信息学、双侧t检验等方法比较分析，实时荧光定量PCR检测相关基因，结果发现差异表达基因54条，72?2%下调，其中与营养物质代谢和免疫调节相关差异表达基因45条，71?1%下调，差异基因中有4条基因为显著差异表达基因(P<0?05)。实时定量PCR检测差异基因5条，4条与芯片结果一致：其中核糖体蛋白S20(ribosomal protein S20，RPS20)、ACAA2(acetyl?coenzyme A acyhransferase 2，脂类/脂肪酸代谢)为下调，精胺合酶(spermine synthase，SMS)、肌球蛋白(myosin，heavy chain 9，non?muscle，MYH9)为上调。1条不符合，核糖体蛋白35(ribosomal protein L35，RPL35)在芯片为下调，在PCR为上调。研究最后获得脾气虚患者4条明确与营养物质代谢相关的基因[9]。为了进一步从分子水平阐述脾虚证的本质，我们拟采用RNAi技术，在体外(IEC?6细胞)实验中对以上脾虚证相关基因进行生物功能鉴定。

　　RNAi是转录后水平的基因沉默，具有特异性、高效性等特点[2]。该技术实施的关键之一是采用合适的方法将制备好的siRNA输送进入细胞内。特异性靶向某基因的双链siRNA进入细胞内的核苷酸输送系统已经被开发：包括“病毒载体”和“非病毒载体”。“非病毒载体”家族包括许多包裹和输送不同类型的核酸进入细胞内并发挥基因活性的方法，包括阳离子脂质体复合物、多聚物或两者合用、亲水性保护多聚物以及电击法和基因枪法等物理输送法[10]。
阳离子脂质体由带正电荷的脂质双层组成，与带负电荷的siRNA结合后形成复合物，然后脂质体上剩余的电荷与细胞膜上的唾液酸残基的负电荷结合[11]，通过内吞作用将siRNA导入细胞内[12]。阳离子脂质体法具有较高的转染效率，不但可转染其他化学方法不易转染的细胞系，而且还能转染从寡核苷酸到人工酵母染色体中不同长度的DNA、RNA和蛋白质。此外，脂质体体外转染可以同时适用于瞬时表达和稳定表达，与以往不同的是，脂质体还可介导DNA或RNA进入动物或人体内用于基因治疗[13]。

　　利用脂质体转染法最重要的就是防止其毒性并保证细胞较高的存活率，因此脂质体与siRNA的比例[14]、细胞类型[15]、细胞种植密度[16]等都是影响转染效率的重要问题，但转染成功的关键还是转染试剂和siRNA的比例，不同种类的细胞该比例是不同的。本实验采用阳离子脂质体转染FAM?siRNA片段进入IEC?6细胞内，通过调整转染试剂Lipofectamine2000和FAM?siRNA的剂量，分别采用荧光显微镜和流式细胞仪观察转染后荧光强度的大小，进而评价转染效率，以期获得后期实验中针对靶蛋白具有不同干扰效率的细胞模型。

　　利用荧光显微镜观察荧光强度过程中，我们发现在转染试剂改变的情况下，相对于FAM?siRNA 80 nmol/L和160 nmol/L 来说， FAM?siRNA 40 nmol/L 所表达的荧光强度都较弱，说明低剂量的siRNA片段可能无法保证达到较高的干扰效率。而在转染试剂不变时，FAM?siRNA 80 nmol/L和160 nmol/L 两组所表达的荧光强度都相近。综合以上两点，同时考虑到过高剂量的转染试剂有可能会对细胞产生较高的毒性[14，17]，而且肉眼观察荧光强度所得出的结论具有一定的主观性，所以本实验采用流式细胞仪定量检测荧光强度。参考荧光显微镜检测结果，排除了FAM?siRNA 40nmol/L和转染试剂2?0 μL 2个条件之后，在转染试剂1?0 μL至1?5 μL之间，结果发现转染试剂剂量越低，其荧光表达阳性率越高，而FAM?siRNA剂量越高，其荧光表达阳性率越高。说明只有siRNA 与转染试剂比例相匹配时，才能达到较高的转染效率。教育教学论文发表

　　从流式细胞仪检测结果看，siRNA与转染试剂比例不同，转染效率也会不同，进而干扰效率也不同。根据此结论，后期实验中，在IEC?6细胞上针对脾气虚证相关功能基因进行干扰，改变siRNA与转染试剂的比例，可以得到不同程度的干扰靶基因后的IEC?6细胞模型。通过对靶基因mRNA或蛋白表达水平的检测，可以探讨靶基因表达的高低对细胞或整体生理功能的影响，研究其生物学功能及其与脾气虚证的关系。

　　以24孔培养板为例，经过2次实验筛选，认为FAM?siRNA 160 nmol/L(20 μmol/L，4?8 μL，终体积为0?6mL)+ Lipofectamine2000 1?0 μL的组合，即体积比为4?8∶1，为IEC?6细胞RNA干扰时转染效率最高的转染条件。我们已完成的在IEC?6细胞RNA干扰核糖体蛋白RPS20的实验也证明该转染条件是可行的(另文发表)。